小鼠听觉辨别学习后脑区突触蛋白质组的高分辨率定量分析

该蛋白质组学方法的总体目标是表征学习与记忆形成后突触处的分子重排，以理解其基本机制和信号通路。该技术的主要优势在于其无需预先假设，能够对突触蛋白质组中的翻译后修饰进行大规模定量分析和表征。我们已建立的工作流程可实现特定分子变化与特定行为之间的关联分析。

学习与记忆的形成基于突触效能的改变，因此蛋白质组学研究应更多关注突触结构（如突触小体）的分析，而非脑组织匀浆。蛋白质组学结果表现为高度复杂的數據集，需进行生物信息学处理。训练开始时，将待测小鼠置于隔音室内光线较暗的穿梭箱中。

采用完全由计算机控制的学习时间表进行听觉辨别学习。在开始训练会话前，先进行三分钟的静音习惯化期。在“go”试验中，动物必须在音调呈现后的六秒内越过障碍，才能记为一次正确反应。

在非进行试验中，动物需在提示音播放的六秒内停留在穿梭箱的当前隔间内。以伪随机顺序进行30次进行试验和30次非进行试验，每次试验之间间隔20秒，使单次实验共包含60次试验，持续约25分钟。完成所有试验后，将训练过的小鼠放回饲养笼，直至处死。

处死小鼠并取出脑组织后，利用血管和脑表面形态等视觉标志定位听觉皮层。然后使用手术刀和针头双侧解剖听觉皮层，获取一块矩形组织。以视交叉为解剖标志，从前囟3.56 mm至1.54 mm之间切取额叶皮层脑片。

在前囟1.54至0.5 mm之间切取纹状体的脑片，并小心去除皮层组织。通过将针插入小脑固定脑组织，从枕叶开始展开皮层，以分离海马体。

将解剖的脑组织样本在液氮中进行无冲击冷冻。开始突触体纯化时，将解剖得到的脑组织转移至含有1毫升冰冻Buffer A的匀浆器中。然后以900转/分钟的速度进行匀浆，约12次冲程。将样品在1,000 ×g下离心10分钟。

离心后，保留上清液。将沉淀物重新混悬，方法同前，并合并上清液。将合并后的上清液在12,000 × g 条件下离心20分钟。将沉淀物重悬于1毫升匀浆缓冲液中，以900 rpm进行6次抽吸混匀，随后在1,200 × g 条件下离心20分钟。

在离心制备P2沉淀的过程中，于超速离心管中配制蔗糖浓度梯度。首先加入2.5毫升1.0摩尔蔗糖缓冲液，然后用玻璃巴斯德吸管将1.5毫升1.2摩尔蔗糖缓冲液小心地铺在下层。离心结束后，向P2沉淀中加入0.5毫升0.32摩尔蔗糖缓冲液。

然后使用六次 strokes 重新匀浆。将匀浆后的组分加在梯度液顶部。将加样后的梯度液放入摆动桶转子中，随后在超速离心机中以 85,000 ×g 离心两小时。

离心完成后，弃去上层0.32摩尔蔗糖溶液，包括与1.0摩尔蔗糖缓冲液交界处的物质。收集位于1至1.2摩尔蔗糖缓冲液交界处的突触体。按1.1的比例向突触体组分中加入0.32摩尔蔗糖缓冲液。

小心混匀，然后在150,000 ×g条件下离心一小时。突触体位于沉淀中，可用缓冲液重新悬浮，以进行后续处理。将一只动物每个脑区的突触体溶解于20至50 µL的8 mol/L尿素中，在冰上于超声水浴中孵育一小时。

用可去除的去垢剂稀释至终浓度为1%，以确保尿素终浓度为2摩尔。通过SDS-PAGE确定蛋白相对含量后，将每个样品剩余部分的三分之一移入新的离心管中。加入2毫摩尔DTT和25毫摩尔碳酸氢铵，轻轻涡旋混匀，进行溶液内消化。

在20摄氏度下还原样品45分钟。加入10毫摩尔碘乙酰胺以羧甲基化半胱氨酸残基，并混匀。在20摄氏度避光孵育30分钟。

最后，加入1 µL胰蛋白酶储备溶液，在20 °C下孵育12小时。为去除酸可裂解的去垢剂，加入三氟乙酸至终浓度为1%，并在20 °C下继续孵育1小时。将样品在16,000 ×g下离心10分钟，小心收集上清液。

将固相萃取柱置于支架上，用两毫升甲醇平衡柱基质。洗涤后，加入额外的两毫升缓冲液B，然后上样。用缓冲液B洗涤三次后，加入200微升70%乙腈和0.1%三氟乙酸洗脱肽段。

然后在真空离心机中干燥纯化的样品。在此示例中，接受FM音调辨别任务训练的动物在训练过程中击中率逐渐升高，而误报率逐渐降低。从第四次训练 session 起出现显著的辨别能力。

在完成首次训练后24小时，比较了接受FM音调分辨任务训练的小鼠与未训练的对照小鼠之间特定蛋白的突触相对丰度。训练后，所有研究脑区中CYFP2蛋白的水平均发生改变。请勿忽视动物个体内部常存在的变异性。

因此，强烈建议在研究中包含至少五个或更多匹配良好的动物组生物学重复。一旦建立，该技术可轻松推广至其他物种。例如，该技术已用于监测单个果蝇大脑中与学习相关的蛋白质表达变化。