利用 CyVerse 资源进行 从头合成 非模式生物的比较转录组学

本实验的总体目标是从原始 FASTQ 文件出发，通过从头转录组学（De Novo transcriptomics）对差异基因表达进行评估、组装、注释和比较。该方法有助于回答比较生物学和分子生物学中的诸多问题，例如生物体内包含哪些转录本、这些转录本在生物体内的功能是什么，以及不同实验条件之间存在哪些差异。该技术的主要优势在于提供了一个交互式分析环境。

它提供按需计算资源，使研究人员能够立即开始分析其RNA-Seq数据。该方法特别适用于在同一生物体内部比较涉及多种组织、条件或时间点的实验，以理解生物系统如何变化。该方法主要针对无基因组的非模式生物，但也可应用于已有基因组组装的生物体，即使其基因组组装包含数万至数十万个 Scaffold。

首先，在 Discovery Environment 中获取对 Atmosphere 的访问权限。通过访问注册页面申请免费的 CyVerse 账户。请使用机构邮箱注册账户。

接下来，导航至应用程序与服务选项卡，并申请访问 Atmosphere。对 Discovery Environment 的访问权限将自动授予。登录 Discovery Environment（简称 DE），然后选择“数据”选项卡，以打开包含数据存储中所有文件夹的菜单。

创建一个主项目文件夹，用于存放与该项目相关的所有数据。在数据窗口顶部找到工具栏，选择“文件”菜单中的“新建文件夹”。在文件夹名称或任何输入输出文件名称中，请勿使用空格或特殊字符。

相反，应在适当位置使用下划线或连字符。将原始 FASTQ 序列文件及文件夹 1_Raw_Sequence 上传至一个名为 Folder A_Raw_Reads 的子文件夹中。对于小于两吉比特的文件，可通过点击主 DE 桌面中的 Data 按钮，进入数据窗口工具栏，使用数据存储的简单上传功能进行上传。

选择“上传”，然后选择“从桌面简单上传”。接着，点击“浏览”按钮，导航至本地计算机上的原始 FASTQ 测序文件。使用 DE 中的 FastQC 工具评估已上传的原始测序读段。在 DE 主桌面点击“应用程序”按钮，打开一个窗口，其中包含 DE 中所有可用的分析应用程序。在窗口顶部的搜索工具栏中搜索 FastQC 工具。

如果存在多个 FASTQ 文件，请打开多文件版本。选择文件并创建一个新文件夹，然后将该文件夹选为输出文件夹。将 FASTQ 测序文件加载到名为“选择输入数据”的工具窗口中，然后选择“启动分析”。

在DE中搜索可编程的Trimmomatic应用程序并打开。将原始FASTQ读取文件的文件夹上传到设置部分。选择测序文件是单端还是双端。

通过点击“浏览”按钮并粘贴文件路径到查看框中，选择所提供的标准控制文件。选择 Trimmomatic 控制文件并启动分析。对于序列读段的质量修剪，请在 DE 中搜索并打开 Sickle 应用程序。选择经修剪的 FASTQ 读段作为输入读段，并重命名输出文件。

在选项中包含质量设置。通过访问 wiki 页面打开最新版本的 Atmosphere 实例。选择 Trinity 和 Trinotate 镜像最新版本的链接。

点击“登录以启动”按钮，然后为 Atmosphere 实例命名。选择 medium3 或 large3 的实例规格。启动实例并等待其构建完成。

如果 Atmosphere 镜像无法启动，可以尝试申请较小的实例，或者向 Jetstream 申请更大的资源配额。所有详细信息均位于配套的 Wiki 页面中。将 Trinity 输出文件移至桌面环境（DE）中的 3_Assembly 文件夹，并将该文件夹命名为 A_Trinity_de_novo_assembly。

运行 Trinity 需要具备命令行知识，并且可能需要数天甚至数周时间才能完成大规模分析。维基页面上提供了相关的免费资源链接，有助于理解命令行操作。将每个组装得到的转录组分别存放在 A_Trinity_de_novo_assembly 文件夹内的独立子文件夹中。

使用包含每个转录组相关生物体的科学名称和处理方法的唯一名称，然后在 3_Assembly 文件夹中创建另一个名为 Folder B_rnaQUAT_Output 的子文件夹。打开名为 De Novo rnaQUAST 的应用程序。为分析命名，并选择 Folder B_rnaQUAST_Output 作为输出文件夹。

在 Discovery Environment 中搜索 transcript decoder，并对从头 Trinity 组装输出的 fasta 文件运行 TransDecoder。在 DE 中打开 DESeq2 应用程序。命名分析并将输出文件夹选择为 4_Differential_Expresssion。在输入部分，选择来自 Trinity 组装运行的计数表文件。

同时，选择包含重叠群名称的列。输入计数数据表文件中的列标题，以确定需要比较的列。各条件之间需用逗号分隔。

不要包含含有重叠群名称的第一列标题。对于重复样本，使用相同的名称。在第二行中，提供要比较的两个条件的名称。

匹配第一行中提供的列标题名称。此处展示的是在每个预处理步骤后对测序读段进行的系统性比较。经过修剪后，读段的 GC 含量和序列组成应更加均衡，并且具有较高质量得分的读段比例应更高。

高质量的测序读段对于从头组装转录组至关重要。快速质量控制的结果取决于所测序的生物体和样本。预处理读段的主要目标是确保所有待比较样本之间的一致性。

rnaQUAST 利用 boost 代码，基于分类群中的已知核心基因生成有关组装结果的汇总统计信息。通过每条转录本的错配数量以及与经典基因匹配的转录本数量，可以揭示组装工具的准确性。此处展示的最后四个子图提供了关于重叠群（contig）和异构体长度的汇总统计信息，以及预期异构体的覆盖情况。

NAx 表示长度超过 y 轴所示长度的重叠群所占的百分比。组装片段比例是指最长的单个组装转录本与其长度的比值。而覆盖比例是指根据 BUSCO 中核心原核或真核基因预期的完整组装转录本异构体所占的百分比。

观看本视频后，您应能充分理解如何组装和分析转录组。此外，本实验方案可帮助您检测两种条件下基因表达的差异。通常情况下，人们在使用生物信息学软件包时会遇到困难，原因是这类软件包数量众多，各自包含大量设置和变量，而且通常需要掌握命令行操作知识才能实际运行。

标注并整理数据输入和分析输出非常重要，以便其他研究人员能够理解所进行的操作。应包含步骤的执行顺序、程序版本和样本信息。此外，文件夹或文件名称中不得包含空格。

新工具及工具的新版本正在不断集成，同时旧版本的工具也会予以保留。所有变更都将在配套的 Wiki 页面上进行记录。通过遵循此流程，还可执行其他生物信息学分析方法，如网络分析、GO 富集分析和代谢通路鉴定，以帮助回答表型变异、导致表达谱变化的条件，以及功能基因组学中目标基因的筛选等问题。