C. elegans RNA测序数据通过Galaxy平台上的Tuxedo软件套件进行转录组分析

本实验方案的总体目标是帮助缺乏生物信息学专业知识的秀丽隐杆线虫（C.elegans）研究人员开展RNA测序实验，并利用开放获取平台Galaxy分析数据。该方法有助于分析复杂的高通量测序数据，揭示C.elegans表型背后的转录组特征。该技术的主要优势在于，即使没有生物信息学背景的科研人员也能分析原始测序数据，获得差异表达基因列表及其相关的基因本体（gene ontology）术语。

尽管该方法专门针对秀丽隐杆线虫（C.elegans）测序数据的细微特征而设计，但也可应用于其他生物体及生物学背景，特别是在需要分析基因组关键转录变化的情况下。本视频介绍 Galaxy 分析流程的基于网页的使用方法。如条件允许，建议在本地运行该工作流程。

请根据维基页面上的说明下载并安装 Galaxy。在使用 Galaxy 主页上提供的“从此处开始”教程后，请观看本视频。用户必须熟悉 Galaxy 的用户界面以及工作流程中所使用的工具。

首先，单击页眉面板中的“分析数据”以进入分析主页视图。右上角的进度条用于监控已使用的磁盘空间。接下来，在左侧面板中访问工具菜单，然后单击 NGS RNA 分析。

这提供了使用分析RNA序列数据所需所有工具的选项。现在，开始一个新的分析历史记录。转到右侧的历史记录面板。

单击齿轮图标，然后从弹出菜单中选择“创建新项目”选项。接着，在历史记录下输入名称以标识该分析。要继续操作，请转到工具菜单，在“获取数据”下点击“上传文件”功能，以上传原始的 fastq 文件。

任务在分析界面打开后，单击“选择本地文件”或“选择FTP文件”，浏览并选择相应的序列数据。默认情况下，Galaxy将自动检测文件类型。然后从下拉菜单中选择生物体，本例中为C.elegans。

接下来，单击“开始”以启动数据上传。文件上传完成后，该操作将保存在历史记录面板中，可从中选择并访问数据。现在，通过进入NGS质控与处理菜单，选择fastq groomer工具，然后在“待处理文件”下选择相应文件，将fast队列格式的文件逐个转换为fastq Sanger格式。

选择适当的输入快速等值分数类型，并使用默认参数运行工具。现在可以分析数据文件。在整个实验方案中，请特别注意所使用的文件格式和测试参数。

这些知识对于排查检测失败及其他问题非常有价值。可在继续操作前进行质量控制检测。文本方案中提供了有关运行这些检测的详细信息。

当文件准备好后，首先打开NGS RNA分析部分，然后点击top hat工具，以对测序数据进行比对分析。在下拉菜单中，回答“这是单端还是双端数据？”的问题。接下来，选择适当的fastq文件。

在下一个下拉菜单中选择使用内置基因组，并选择参考的 C.elegans 基因组数据。其他所有参数选项均选择默认值，然后点击执行。为了估算数据集中转录本的相对丰度，请在 NGS RNA 分析部分选择 cufflinks 工具，并在第一个下拉菜单中选择来自 tophat 分析得到的已比对的 accepted hits BAM 格式文件。

从第二个下拉菜单中，将参考注释设置为包含当前基因组数据的 GTF 文件。当出现执行偏差校正选项时，选择“是”，并使用默认设置运行任务。接下来，从 NGS RNA 分析菜单中打开 cuffmerge 工具，以合并为所有 RNA 测序样本生成的转录本。

工具中的第一个框将加载上一步使用 cufflinks 生成的所有 GTF 文件。现在，选择每种菌株或测试条件（包括同种菌株条件的生物学重复）的组装转录本文件。在“使用参考注释”选项中选择“是”，并选择参考基因组数据文件。

接下来，选择“使用序列数据”选项为“是”。系统将自动检测并选择合适的参考基因组。其余所有参数保持默认设置，然后点击执行。

将生成单个 GTF 文件。如需比较多个菌株或条件，请返回 NGS RNA 分析部分并选择 cufflinks 工具中的 cuffdiff 工具。然后，在 cuffdiff 工具的 transcripts 菜单中选择来自 cuffmerge 的合并输出文件。

然后输入两个条件的标签。对于每个条件，进入“replicates”并选择与该条件下不同生物学重复对应的 TopHat 输出的已接受比对结果文件。要同时选择多个文件，请按住 command 或 control 键。

选择文件后，使用默认参数设置，点击执行以运行任务。在历史面板中生成的基因差异检测框内，点击保存图标下载差异表达数据。首先，从网站访问 David。

从网页页眉中选择“开始分析”。将从 Galaxy 获得的基因列表复制到 A 框中，在本示例中选择基因标识符为 WormBase 基因 ID。然后在问题三的列表类型中选择“基因列表”，并点击“提交列表”图标。此时将打开分析向导主页，从中可选择 DAVID 任务。

本视频片段介绍了其中的一些选项。首先，选择功能注释聚类以进入摘要页面。保持注释类别的默认设置，然后点击功能注释聚类。

此选项会根据富集得分对相似的注释术语生成聚类。现在，返回分析向导，选择功能注释图表选项，以鉴定与基因列表显著相关的生物学术语。DAVID 的一个重要功能是可生成功能注释表格。

此列表展示了与基因相关的所有注释，但不显示任何统计学计算结果。这对于逐个基因的分析以及查找特定感兴趣基因非常有用。另一个值得查看的 DAVID 工具是基因功能分类。

该选项根据基因的富集得分，将基因分类为一系列功能相关的基因组列表。所述实验方案用于鉴定在生殖系缺失后由 tcer-1 调控其表达的基因。通过比较长寿的生殖系缺失 glp-1 突变体与同样缺失生殖系但不表现出寿命延长的 tcer-1 glp-1 双突变体的转录组，实现上述目的。

对序列进行质量检测后，未发现低质量的读段，GC 含量为 48% 至 49%，序列读长恒定为 51 个碱基对。样本的基因组覆盖度估计在 7 倍至 11 倍之间。Galaxy 可用于整合每种菌株两个重复样本的 NGS 数据，并进行差异分析，从而生成基因列表，以突出显示全基因组表达谱。

总体而言，在两种菌株之间，共有835个基因差异表达，采用的P值截断值为0.05。对上调基因进行功能注释分析，发现四个富集得分较高的注释簇。其中富集最显著的是细胞色素P450和异生物质反应相关基因，其次是参与脂质修饰的基因。

对下调靶基因的功能注释聚类也鉴定出多种注释聚类，其中包括细胞骨架功能、生长的正向调控、繁殖以及衰老相关的富集聚类。Galaxy 分析流程为众多生物学领域的研究人员提供了快速高效分析大规模基因表达变化的途径。

观看本视频后，您应能够开展 RNA 定向实验，并利用 Galaxy 流程分析原始的高通量测序数据。您还应能够使用 DAVID 平台从 Galaxy 数据中提取具有生物学意义的信息。