蛋白质的制备、结晶与结构测定 C. difficile PPEP-1 的微晶种法结合锌单波长反常散射法

本实验的总体目标是高效培养出可用于单晶衍射分析的重组脯氨酰内肽酶-1（rPPEP-1）蛋白的高质量单晶。若不采用此方法，rPPEP-1 会立即形成严重孪生的晶体，无法适用于X射线衍射分析。该技术的主要优势在于，可在较短时间内使用有限的材料获得大量结构有序且衍射质量良好的晶体，从而实现对 rPPEP-1 的结构解析。

该实验步骤采用微晶法，可适用于rPPEP-1及其底物肽复合物的任何成功初始结晶条件。该方法可进行调整，用于制备几乎所有能产生孪生晶体的蛋白质的有序晶体。此外，该方法还可应用于交叉接种实验、蛋白质变异研究，或与小分子的共结晶实验。

结晶方法操作过程的可视化演示至关重要，因为即使微小的差异也可能对晶体的衍射质量产生显著影响。采用标准市售筛选试剂盒和结晶机器人，以坐滴法进行结晶试验。首先，使用离心超滤装置将纯化的蛋白质浓缩至每毫升12毫克，在4000 × g 条件下、4 °C 温度下每5分钟进行一次浓缩。

每次间隔后混合蛋白质溶液，以防止沉淀和加剧。通过使用25,900 M⁻¹cm⁻¹的消光系数，在280纳米处测定蛋白质浓度。将蛋白质在20摄氏度平衡后，于20摄氏度、16000 × g离心10分钟，以去除所有颗粒和灰尘。

进行结晶筛选时，使用预先填充并密封后储存在4摄氏度的结晶板。设置实验时应迅速操作，因为小体积液滴会迅速干燥。如果可能，还应在机器人操作平台周围使用湿度控制舱。

将所有结晶板平衡至20摄氏度后，通过移液将蛋白质与储液混合物加入2至4号子孔中进行筛选。液滴体积为300纳升。2号子孔的蛋白质与储液比例为200:100，3号子孔为150:150，4号子孔为100:200。

立即密封培养板并将其置于20摄氏度的培养箱中。在设置后的第一周内每天检查培养板，之后每周检查一次。对于底物肽rPPEP-1复合物的共结晶，将rPPEP-1以24毫克/毫升的浓度与七倍摩尔过量的肽溶液按1:1比例混合，肽溶液由溶于Tris缓冲盐水的冻干粉末制备。

在20摄氏度下孵育30分钟后，于20摄氏度、16000 × g条件下离心10分钟，以去除所有颗粒和灰尘。采用与未结合的rPPEP-1蛋白相同的微晶接种方法进行结晶。在含有2.4摩尔磷酸氢二铵和0.1摩尔Tris缓冲液（pH 8.5）的条件下，两天后出现了高度共生的rPPEP-1晶体。

为了优化初始条件，使用软件计算体积和移液方案，以获得每种2毫升的条件，可进行10次优化筛选。条件包括1.8至2.55摩尔的磷酸氢二铵，以0.15摩尔为步长递增，以及0.1摩尔的trisapseal，pH值从7.5至9.0，以0.5个pH单位为步长递增。使用储备溶液配制包含24种条件的网格筛选。

按照移液方案配制各个条件。将每种网格筛选溶液各200微升加入24孔板的孔中，并在20摄氏度下平衡该板。手动设置结晶板。

使用3微升的液滴体积，以及2:1、1.5:1.5和1:2的蛋白质与储液比例。此处使用正向置换移液器以避免产生气泡。立即密封培养板。

然后将该板置于20摄氏度的培养箱中。1至4天后，在含有2.55 mol/L磷酸氢二铵和0.1 mol/L Tris缓冲液（pH 7.5至9.0）的四个条件下，出现大量相互生长的rPPEP-1晶体，而在其余20个条件下则无晶体形成。在这些条件下进行微晶接种操作，以获得rPPEP-1的单晶。

为制备微晶种子原液，首先从一个成功的结晶条件中选取一颗相互生长的单晶。接着，将50微升相应的母液转移至含有一个微小且高度抛光的玻璃珠的1.5毫升离心管中，并取1微升母液滴加到玻璃盖玻片上。使用固定在细针上的尼龙环，挑取晶体并将其转移至玻璃盖玻片上的液滴中。

然后将含有晶体的液体转移至离心管中，高速涡旋振荡30秒，确保玻璃珠充分旋转。取晶种储备液，用新制备的相同条件溶液在新的1.5毫升离心管中进行1:1000稀释，并彻底涡旋振荡5秒。接下来，移除覆盖20个条件且含有清晰液滴的板的密封膜。

将0.5微升的晶种储备液用移液器加入各孔中。密封培养板并将其置于20摄氏度的培养箱中。采用此微晶接种技术后，在含有1.8至2.4摩尔磷酸铵和0.1摩尔Tris（pH 7.5至9）的不同条件下，数小时至数天内即可出现高质量的单晶。

晶体最大尺寸可生长至100至200微米。通过将尼龙环置于晶体上方的密封膜上，并上下调焦，根据所选晶体的最大长度选择最合适尺寸的尼龙环。rPPEP-1晶体的典型最大尺寸约为100至200微米。

同时准备好适当的冷冻条件。将泡沫杜瓦瓶中装入液氮。然后将冻存管夹装上冻存管，并在装有液氮的800毫升泡沫杜瓦瓶中预冷。

将带有合适标识的冷冻罐架和冷冻套管放入装有液氮的两升泡沫杜瓦瓶中。然后，将适当尺寸的尼龙环固定在磁力棒上。接下来，用锋利的手术刀切开结晶板上的密封胶带，并用镊子将其移除。

用移液器吸取一微升冷冻液滴加到盖玻片上。此步骤需特别注意操作速度，因为晶体或悬滴中微量冷冻溶液的干燥可能导致晶体质量波动，甚至完全丧失衍射能力。所有晶体操作步骤均应在体视显微镜下进行。

如果晶体粘附在塑料表面，可用针灸针轻轻变形周围的塑料，使晶体从基底上脱离。用装有尼龙环的工具将晶体从液滴中捞出。迅速将晶体转移至冷冻保护剂液滴中，并使其平衡约一秒钟。

然后尽快用装有尼龙环的镊子将晶体从液滴中捞出。立即将取出的晶体浸入液氮中进行骤冷。当液氮中尼龙环周围的气泡停止沸腾时，将尼龙环放入样品管中。

将小瓶置于冷冻罐支架上。当支架装载六个小瓶后，在支架周围套上冷冻套管。将晶体储存于充满液氮的罐中，直至使用。

进行数据收集时，使用夹钳小心地从冷冻罐中取出已安装的晶体，并将其存放在泡沫杜瓦瓶中以运输。将光束挡板和探测器移至停放位置，并将冷冻喷嘴向上移动数毫米。用手指固定住冷冻帽的底座，迅速取下小瓶，然后将冷冻帽底座安装到测角头上。

然后将冷冻喷嘴和光束挡板移回原位，并对晶体进行居中。在整个过程中，务必小心避免触碰光束挡板或探测器。接着以0.1度的振荡角度采集180度的数据集，如下所示。

图中所示为使用商业结晶筛选试剂盒进行初步筛选所获得的紧密簇生rPPEP-1晶体，结晶条件为1.4摩尔柠檬酸三钠二水合物、0.1摩尔HEPES钠盐，pH 7.5。图中还展示了在60%（体积比）tacsimate、pH 7.0、0.1摩尔BIS-TRIS丙烷、pH 7.0条件下初步筛选获得的晶体。此外，在2.4摩尔磷酸氢二铵、0.1摩尔Tris、pH 8.5条件下也观察到晶体析出。

经过微晶接种优化步骤后，多个条件中均获得了单晶，包括2.1摩尔磷酸氢二铵、0.1摩尔Tris、pH 8，以及2.25摩尔磷酸氢二铵、0.1摩尔Tris、pH 8。用尼龙环捞取的晶体大小为100至200微米，显微镜检查显示其具有单一晶格。X射线衍射分析表明，这些晶体确实呈现单一晶格，并能将X射线衍射至接近原子级分辨率。

解析重组PPEP-1底物肽复合物的晶体结构，有助于深入了解PPEP-1的底物结合模式。底物肽可在PPEP-1处于开放构象时扩散进入其底物结合区域。随后，随着环的闭合，底物通过氢键以及位于S环上的独特脂肪族-芳香族侧链网络与PPEP-1发生相互作用。

底物以一种独特的双重弯曲构象结合，弯曲部位位于sizzle肽键以及P2'至P3'肽键处。观看本视频后，您应能够充分理解如何制备可用于结构研究的单一晶格、良好衍射的重组PPEP-1晶体。类似的方法也可应用于其他蛋白质，通过调整孵育温度和C储备液稀释比例，获得高度共生长的晶体。

由于其多功能性和操作简便，这一简单技术应在每次晶体优化过程中都进行尝试。