通过多功能微流控芯片中的序列晶体学对酶-底物复合物进行结晶及结构测定

您好，欢迎来到斯特拉斯堡分子与细胞生物学研究所的RNA结构与反应性实验室。生长出高质量的衍射晶体是任何晶体学研究中的关键步骤。在本视频中，我们将演示如何使用一种新型微流控工具来生长生物大分子的晶体，并通过原位X射线衍射测定其三维结构。

一种名为ChipX的微流控装置具有多项优势。该装置通过逆扩散法设计，可实现结晶过程的微型化和便利化。其组装简单，可使用标准实验室材料完成。

它还针对芯片内生长晶体的直接表征进行了优化，适用于串行X射线晶体学分析。ChipX消除了晶体操作和低温冷冻步骤，能够在原位和室温条件下保持晶体的本征质量并进行分析。ChipX的外形尺寸与显微镜载玻片相同，为7.5厘米×2.5厘米。

它包含八个用作结晶室的微流控通道，每个通道的截面为80乘以18微米，长度为4厘米。左侧的入口可用于手动注入生物分子溶液，该溶液将填充至八个通道末端的储液区。结晶溶液则被放置在右侧的这些储液区中。

结晶由一种称为逆向扩散的现象引发。当结晶剂扩散进入生物分子溶液时，会形成浓度梯度和过饱和梯度。通道上的标签和标记有助于更方便地定位晶体。

设置芯片需要五到六微升生物分子溶液，典型浓度为每毫升五到十毫克。另需一微升石蜡油、每个储液池五微升结晶溶液以及胶带。ChipX 的加样通过移液器和标准吸头手动完成。

本示例中使用蓝色样品溶液，以便更清楚地观察注射过程。为避免泄漏，将进样针头垂直插入芯片的样品入口。样品之后加载 1 µL 石蜡油，以使各通道相互隔离。

然后用胶带将样品入口密封。八个储液池分别加入五微升的结晶试剂溶液。操作时，将移液枪吸头以约45度角靠近通道末端。

这可以防止样品与结晶试剂之间形成气泡。储液池可填充含有各种缓冲液、聚合物或盐等成分的混合溶液，用于筛选或优化条件。储液池用封口膜密封。

如本演示所示，芯片的安装非常简单，仅需几分钟即可完成。在ChipX中，结晶通过逆向扩散实现。储液池中加入的结晶剂会扩散进入含有生物大分子的通道中。

这会形成浓度和过饱和度的梯度，从而引发结晶。这些是在通道内获得的酶晶体示例。晶体可能生长至填满横截面为 80 乘 80 微米的通道。

使用紫外光下色氨酸残基的天然荧光，或如图所示使用荧光标记蛋白，可通过荧光显微镜在ChipX中轻松检测到晶体。本节展示了在瑞士菲拉格里斯的瑞士光源（Swiss Light Source）进行的克里斯电信分析。芯片可直接送至同步辐射设施，无需任何附加设备或特殊防护。

让我们进入瑞士光源大厅。电子在中心环中循环，产生宽谱的电磁波，包括在不同光束线上利用的X射线。本视频录制于X06光束线，该光束线专用于大分子晶体学研究。

不同同步辐射装置的实验方案可能有所差异，但总体原理保持不变。ChipX被安装在3D打印的支架上，该支架随后固定在标准测角仪的磁体上。

通过持续收集芯片上生长的一系列晶体的数据来进行序列分析。利用芯片通道两侧的标签和标记建立晶体位置列表。研究人员移动芯片，使晶体位于黄色窗口所示的X射线束中心。

启动使用X射线束的快速居中程序。光束挡板升至指定位置，探测器向样品移动。进行网格扫描以确保晶体与光束对齐。

将芯片旋转30度后，重复上述步骤。第二步至关重要，因为芯片材料会产生视差效应，导致衍射极大值相对于观察到的晶体位置发生偏移。一旦晶体在光束中居中，即开始数据采集。

该序列展示了实时数据采集过程。芯片旋转30度，同时探测器收集相应的衍射图像。

该晶体的表征已完成。芯片移至通道中的下一个晶体，整个过程重复进行。需要注意的是，该分析在无需直接接触晶体且在室温条件下原位完成。

随后将收集到的一系列晶体数据合并，以获得完整的衍射数据集，用于计算电子密度图（以蓝色显示）并构建原子模型。本视频中描述的方法已应用于低温适应细菌嗜冷盐球菌（Planococcus halocryophilus）的tRNA修饰酶——CCA添加酶的结构表征研究中。

使用ChipX通过反向扩散法在硫酸铵作为结晶剂的条件下使酶结晶。在20摄氏度下孵育数天后，沿通道出现了双锥形晶体。对蛋白质进行荧光标记有助于识别蛋白质晶体，并将其与盐晶体区分开来。

一系列晶体在原位和室温条件下进行了分析。其衍射数据经合并后，得到了分辨率为2.5埃的载脂蛋白E（APOE）酶的晶体结构。此外，利用芯片通道中环境的扩散效应，将底物递送至酶中，从而促进晶体的形成。

在本案例中，于同步辐射分析前两天，将 CTP 类似物加入到储液溶液中。这使得该化合物得以扩散并到达酶的催化位点。如在分辨率为 2.3 埃的复合物晶体结构中所见。

本视频中展示的方案具有广泛的适用性，并已在多种生物分子上经过测试。综上所述，ChipX 是一种集成化验芯片工具，可将晶体学研究的全部步骤整合在一起，使您能够在单一的微流控装置中从生物医学溶液获得晶体结构。感谢您观看本视频。

我们希望已使您信服，使用 ChipX 来结晶并测定您感兴趣的生物大分子的晶体结构具有诸多优势。