一种快速、可扩展的细胞来源细胞外基质分离、功能研究与分析方法

本实验的总体目标是从培养的细胞中分离细胞外基质，用于多种后续实验，以帮助理解细胞外基质在正常组织和疾病过程中的功能与特性。该方法有助于回答细胞外基质研究领域中的关键问题，例如细胞外基质的结构组织、分子组成、蛋白质相互作用或功能特性。此外，细胞外基质可从任何贴壁细胞类型中制备。

该技术的主要优势在于，可在不同规模下进行操作，从而高效去除细胞并保留细胞外基质蛋白。本次实验操作将由本实验室的研究生 Silvia Rosini 和博士后研究员 Andrew Hellewell 演示。首先，将细胞接种于盖玻片上，用于活细胞及细胞外基质（ECM）的成像观察。

对于荧光显微镜研究，可使用固定的细胞外基质（ECM），或制备用于小规模功能研究的细胞来源ECM。将细胞在适当的温度和湿度条件下孵育足够时间，以使细胞沉积ECM。

通常超过16小时。在通风橱中，使用去离子水将原液按1:14稀释，于合适的容器中配制20毫摩尔的氢氧化铵溶液。从培养箱中取出细胞，轻轻移除培养基。

然后沿培养皿壁轻轻加入不含钙和镁的 PBS。轻轻晃动培养皿两次，倒掉液体。再重复洗涤两次。

在通风橱中，移除最后一次 PBS 洗涤液，每 60 毫米培养皿加入 1.5 毫升氢氧化铵，于室温孵育 5 分钟。每隔 1 分钟轻轻振荡培养皿，以确保所有细胞充分裂解。随后，向每个培养皿中加入大量去离子水，并轻轻摇动培养板。

然后倒掉溶于氢氧化铵的物质，该物质由氢氧化铵、裂解的细胞和去离子水组成。用大量去离子水再清洗不溶性细胞外基质层四次，以确保完全去除所有溶于氢氧化铵的物质。必须通过大量去离子水洗涤彻底清除所有细胞。

如果这些步骤操作不当，细胞物质可能会残留在培养皿上，从而污染后续分析。若需通过免疫荧光检测细胞外基质（ECM），请去除残留的去离子水，加入2%的多聚甲醛（简称PFA）固定ECM，并在室温下孵育10分钟。使用PBS将每个固定样本洗涤两次，并将废液弃入液体废弃物容器中，随后根据文本方案进行荧光显微镜检测。

在超净工作台中，将不含钙和镁的 PBS、20 毫摩尔的氢氧化铵以及去离子水分别通过无菌的 0.2 微米滤膜过滤，注入适当的无菌容器中，制备成无菌溶液。在保持无菌操作的条件下，使用无菌 PBS 轻柔地清洗盖玻片上的基质产生细胞，共清洗三次。在去除最后一次 PBS 洗涤液后，向 60 毫米培养皿中加入 1.5 毫升无菌氢氧化铵，在室温下孵育 5 分钟，并间歇性轻轻摇动。

向培养皿中加入大量无菌去离子水，同时轻轻晃动，然后将细胞裂解液倒入适当的废液容器中。重复此洗涤步骤五次，以确保完全去除溶解的物质。根据文本方案进行胰蛋白酶消化并离心收集细胞后，将待测细胞重悬于新鲜无菌培养基中，并使用血细胞计数板对细胞进行计数。

然后将适量的待测细胞和培养基接种到载玻片上的无菌分离ECM上，孵育2至3小时或所需时间。为观察肌动蛋白细胞骨架的排列结构，用2% PFA固定待测细胞，并使用FITC-Phalloidin染色以显示F-actin，用DAPI染色以显示细胞核。在培养大量细胞后，按照视频中先前演示的方法去除细胞并清洗ECM，将每块培养板倾斜一定角度，使残留液体流至培养皿底部，再用P200移液器小心吸除所有残留水分，直至培养板完全干燥。

同时将含有100毫摩尔DTT的SDS-PAGE上样缓冲液加热至95摄氏度，持续2分钟，并向每块100毫米培养皿中加入200微升，用于免疫印迹分析。使用细胞刮刀将样品收集至培养皿的一侧，再用200微升移液器吸头将其转移至离心管中。若需通过质谱分析细胞外基质（ECM），可通过从培养皿中收集SDS-PAGE上样缓冲液，重新加热至95摄氏度，并将同一等分试样用于额外的两到三块培养皿，以制备更浓缩的样品。

将细胞刮刀尖端残留的SDS-PAGE上样缓冲液提取物转移至离心管中，以尽量减少细胞外基质（ECM）材料的损失。为了有效将分离的ECM提取到SDS-PAGE上样缓冲液中，必须将上样缓冲液加热至95摄氏度，含有还原剂，并对培养板进行充分刮取。图中所示为生长在玻璃盖玻片上的COS-7细胞。

氢氧化铵处理通过细胞核和肌动蛋白细胞骨架的消失证实可有效去除细胞。本图中，COS-7 细胞转染了 RFP 标记的血小板反应蛋白-1，并在氢氧化铵处理前后对细胞外基质进行了可视化观察。

两幅图像中观察到的荧光斑点推断与细胞外基质（ECM）相关。本实验中，使用氢氧化铵去除人真皮成纤维细胞后，利用抗胶原蛋白1抗体对细胞外基质进行检测，显示出典型的纤维状和网状染色模式。如图所示，对经氢氧化铵提取的大鼠软骨肉瘤细胞来源的细胞外基质进行了纤连蛋白染色。

在此示例中，将测试用的 COS-7 细胞接种于由 RCS 细胞产生的无菌细胞外基质（ECM）上培养两小时，随后通过 FITC-鬼笔环肽染色分析 F-肌动蛋白的组织结构。与自身产生 ECM 的 COS-7 细胞进行比较。在本实验中，ECM 来源于大鼠软骨肉瘤细胞，并通过 SDS-PAGE 分离 ECM 来源的蛋白质。

通过质谱分析分离并鉴定了四个主要条带，结果鉴定出纤维连接蛋白、血小板反应蛋白-1以及血小板反应蛋白-5和基底膜蛋白-1。最后，通过免疫印迹分析了人皮肤成纤维细胞的内源性细胞外基质。

检测到纤维连接蛋白和血小板反应蛋白-1，而细胞内蛋白α-微管蛋白和β-肌动蛋白则不存在。熟练掌握后，若操作得当，可在一小时内完成从三个100毫米培养皿中用氢氧化铵去除细胞，并用热SDS-PAGE上样缓冲液提取细胞外基质的步骤。进行该操作时，需注意每次去除细胞时均应新鲜配制氢氧化铵工作液。

使用大量去离子水进行充分洗涤以确保完全去除所有细胞也非常重要。在此步骤之后，可对提取的细胞外基质（ECM）进行蛋白质组学分析等方法，以回答其他问题，例如不同细胞类型产生的ECM蛋白的相对丰度。观看本视频后，您应能够充分理解如何高效地从细胞培养皿中去除细胞，以及如何提取细胞外基质。

请注意，使用多聚甲醛可能具有极高危险性，进行本实验操作时，必须采取预防措施，例如在通风橱中操作并穿戴个人防护装备。