从精细空间表达图谱中解析动态表达数据的时间顺序

本实验方案的总体目标是利用固定组织取样，绘制脊椎动物体节形成时钟的时空基因表达动态图谱。该方法能够无偏倚地评估前体节中胚层中振荡基因的动态变化，这对于理解调控脊椎动物体节发生的分子机制至关重要。该技术的主要优势在于可同时生成并处理大量样本，从而实现对固定组织中基因表达动态的高通量三重分析。

演示该操作的是Charlotte Bailey博士，她曾是我实验室的博士后。根据文本方案获取小鼠子宫角后，在体视显微镜下使用弯头剪刀剪开子宫角较厚的肌层，小心取出每个胚胎。使用弯头剪刀和精细镊子将每个胚胎的羊膜剥离。

然后使用手术针或弯头剪刀，通过在后肢芽前方切割，从每个胚胎上采集尾部组织。将尾部组织腹面朝下放置。接着用手术针沿中线轻轻左右摇动，将尾部组织切分为两半，从而获得成对的PSM外植体。

确保神经管、脊索和体节前体组织（PSM）在两个外植体之间均等分配。然后用移液器将每个对侧的体节前体外植体分别转移至一个35 mm塑料培养皿盖的底部，加入少量预热的培养液。将培养皿放置在皿盖上方，迅速倒转，使体节前体组织悬垂于皿盖下方的液滴中进行悬滴培养。

然后将体节外植体置于湿润的培养 chamber 中，在 37 摄氏度下培养 1 至 2 小时。将成对的体节外植体转移至 24 孔组织培养板的各个孔中。随后向样品中加入含 4% 多聚甲醛的 PBS 溶液，室温孵育 1 小时，或在 4 摄氏度下于摇床上过夜孵育。

孵育结束后，在摇床上于室温下用 PBS 洗涤样本孔。使用细塑料巴斯德移液管，将样本中的 PBS 溶液更换三至四次。进行免疫组织化学染色时，向每对胚胎中的一个 PSM 外植体加入含 2% Triton X-100 的 PBS 溶液，并在摇床上于室温孵育一小时，以洗涤样本。

用 PBS 短暂冲洗样本，然后将 PBS 替换为封闭液，在摇床上于 4°C 条件下孵育过夜。使用工作缓冲液稀释所需的一抗。

在此示例中，使用稀释比例为1:25的Delta样蛋白1和Notch1抗体。将抗体加入组织块中，并在4°C条件下于摇床上孵育3至5天。孵育结束后，用PBS清洗样本两次，每次5至10分钟。

然后在室温下，于摇床上用含0.3% Triton X-100的PBS溶液洗涤三次。将二抗用工作缓冲液稀释后，向每个样本孔中加入250–500 µL抗体溶液，注意避免使用最后几微升溶液，因其可能含有抗体聚集体。用锡箔纸覆盖板孔，将样本在4°C避光条件下孵育于二抗溶液中，孵育时间为3至5天。

孵育后，用 PBST 洗涤样品两次，每次十分钟。然后在摇床上用 PBS 室温洗涤组织一次，持续五分钟。根据实验方案，通过乙醇-PBST 梯度稀释系列对剩余的对侧 PSM 外植体进行脱水和再水化处理。

向组织块中加入含有0.1% PBST的蛋白酶K，终浓度为每毫升10微克，在无振荡条件下孵育5分钟。随后迅速移除蛋白酶K溶液，并用PBST短暂清洗样品。向体节组织块中加入含4%甲醛和0.1%戊二醛的PBST溶液进行后固定，孵育30分钟。

然后，用PBST将样品洗涤两次，每次十分钟。加入50%杂交液至组织中，在65摄氏度下静置孵育十分钟。根据文本方案完成样品与杂交液的孵育后，移除溶液，并加入0.25至0.5毫升预热的杂交液，该杂交液中含有针对已知体节时钟组分的地高辛标记的反义RNA探针。用胶带密封培养板，将样品在65摄氏度下孵育两个夜晚。

孵育结束后，用预热的含50%杂交混合液的TBST洗涤样本15分钟。随后用TBST冲洗样本两次，再将组织置于TBST中，在室温下于摇床上孵育30分钟。接着，将外植体在封闭液中预孵育至少两小时。

然后用新鲜的封闭液替换原有溶液，封闭液中加入1:200稀释的HRP标记抗地高辛抗体。将样品在4°C条件下孵育过夜。次日，用TBST在室温下清洗样品三次，并将其转移至新的24孔细胞培养板的各个孔中。

然后用TBST缓冲液每次一小时，洗涤外植体三次。在准备样品进行成像之前，使用酪胺信号放大试剂盒对检测到的mRNA进行可视化。通过从厚度为0.12 mm的成像间隔片上移除粘性衬垫并将其粘附到玻片上，为每对外植体准备一张带电荷的粘附玻片。

根据文本方案，将一对外植体放置到载玻片上后，让样品在载玻片上黏附 45–60 秒，直至组织开始呈现黏稠且半透明的状态，但不要完全干燥。在此期间，使用镊子移除间隔垫圈上剩余的黏性衬垫，并在间隔垫圈中央的样品上加入一大滴兼具封片和透明化功能的介质溶液。将圆形盖玻片覆盖在样品上，确保封片介质均匀分布，并且盖玻片所有边缘均与间隔垫圈接触。

然后将盖玻片朝下放置在低絮状纸上。用力按压，确保盖玻片完全粘附于间隔片上，并去除多余的封片介质。重复此步骤，直至不再有封片介质被吸到纸上为止。

清洁并标记载玻片，然后避光保存直至成像。随后根据正文中的实验方案进行成像和分析。在本实验中，通过将胚胎暂时按照每个外植体配对中检测到的、由Notch信号调控的节律性基因lunatic fringe内含子区新生转录本的表达情况进行排列，显示Delta-Like 1与Notch1蛋白的表达呈现不同步的振荡模式。

图中各面板按照体节时钟周期的第一、第二和第三阶段排列。Delta-Like 1、Notch1 和内含子型 lunatic fringe 在 PSM 前后轴方向上的表达区域范围由不同颜色的条带标示。如图所示，通过绘制图表来量化 Delta-Like 1、Notch1 和内含子型 lunatic fringe 信号强度与 PSM 前后轴位置的关系，展示了在整个时钟周期中 PSM 不同轴向位置的信号强度变化。

显影图展示了多个体节中胚层（PSM）中Delta-Like 1、Notch1和内含子型lunatic fringe在空间上的分布情况。显影图中的每一行代表一个独立的PSM外植体的信号强度。对Delta-Like 1、Notch1和内含子型lunatic fringe信号强度沿PSM前后轴的定量分析表明，这些靶标呈现出明显的振荡表达动态。

最后，这些延时图像显示了裂解并激活形式的 Notch 受体 NICD、Delta 样蛋白 1、内含子型 lunatic fringe 以及 Notch1 在多个体节前体中胚层（PSM）中的空间分布情况。该技术已帮助脊椎动物体节发生领域的研究人员更好地理解鸡和小鼠体节前中胚层中节段基因的振荡动态。一旦掌握，该技术可应用于大量样本，从而能够同时分析多种目标 mRNA 和蛋白质的表达谱。

通过该实验流程，对图像数据进行进一步定量分析，可帮助研究人员了解基因表达的时间延迟，以及目标RNA和蛋白质信号在细胞内的定位情况。观看本视频后，您应能够充分掌握如何利用厚组织取样技术，对脊椎动物体节时钟中的时空基因表达动态进行解析。随后可按照文字版实验方案中详述的方法，进行自动化的图像分析。

进行该实验操作时，需确保在PSM外植体之间均匀分配体节中胚层（PSM）、脊索和神经管，并在开始前仔细优化抗体稀释比例。请注意，甲酰胺、多聚甲醛和戊二醛的使用可能具有极高危险性，应谨慎佩戴个人防护装备，并在适用情况下于通风橱内操作。