使用硝酸纤维素结合实验定量细菌组氨酸激酶自磷酸化

本实验方案的总体目标是定量检测纯化的细菌组氨酸激酶的自磷酸化。该方法有助于回答双组分信号转导领域中的关键问题，例如，相应的刺激因子对组氨酸激酶自磷酸化过程中蛋白质-蛋白质相互作用的影响。

该技术的主要优势在于它是一种高通量方法，可用于准确定量生成的皮摩尔级磷酸化组氨酸，并获得组氨酸激酶的动力学参数。作为一名博士后研究员，我曾采用硝酸纤维素膜过滤法来定量蛋白质结合的放射性配体。因此，开发一种类似的技术来定量细菌组氨酸激酶中的组氨酸磷酸化是合乎逻辑的选择。

按照文本方案中的描述，首先准备试剂和材料。要组装96孔点印迹装置，裁剪一块8厘米×12厘米的硝酸纤维素膜。将硝酸纤维素膜放置在点印迹装置中。

确保膜片安装到位，使装置密封且所有孔完全被膜覆盖。为收集滤液，将装置连接至一个辅助侧臂烧瓶。从阀门接头处连接足够长度的管路，以便装置使用时不会倾倒辅助烧瓶。

然后，将二级侧臂烧瓶连接至抽气泵真空源。通过向装置施加真空来测试装置是否完全密封。如果装置组装正确，所有孔中均会出现强真空。

所有管路连接均可用帕拉膜（Parafilm）或保鲜膜包裹，以确保密封紧密。在开始之前，按照文本方案所述，将四种反应组分分别配制成四种X倍浓缩液。取等体积的反应缓冲液、组氨酸激酶和双蒸水混合。

让这些反应组分在室温下短暂平衡。为启动反应，加入等体积的 γ-32P ATP 溶液，并通过上下吹打混匀。使用计时器记录反应进行的时间，并让反应持续指定所需的时间。

终止反应。将反应液的一份等分试样加入325毫摩尔磷酸中。立即将终止后的反应液置于冰上，直至所有反应均完全停止。

将预先组装好的96孔点印迹装置放入一个次级容器中。该容器应足够大，以便于在其中轻松拆卸装置，因为使用后的装置和膜将具有放射性。对96孔点印迹装置施加真空。

当装置处于真空状态后，小心地将淬灭的反应液直接用移液器加到每个孔中的硝酸纤维素膜上。重复此过程，直至所有反应液均已被点样至膜上。由于硝酸纤维素膜的结合能力大于所点样的组氨酸激酶的量，因此可以认为当正确点样时，几乎所有的激酶都会结合到膜上。

根据所用装置的不同，需注意不要刺穿硝酸纤维素膜。确保反应液全部与硝酸纤维素膜接触，因为部分反应液容易粘附在孔壁上。

用 100 微升冰浴的 25 毫摩尔磷酸溶液清洗各孔。此步骤可使可能滞留在孔中的任何反应液体流入膜中，确保所有反应完全上样。让全部液体流过膜。

在关闭真空泵之前，请小心拆卸装置。请注意，此时装置和硝酸纤维素膜均具有放射性。不得将任何装置组件从次级容器中取出。

用镊子小心地将硝酸纤维素膜从装置转移到含有约 200 毫升 25 毫摩尔冰冻磷酸缓冲液的容器中。盖上容器盖子，因为洗涤液具有放射性。此时可关闭真空泵。

将装有洗涤膜的容器置于摇床上，轻轻摇动20分钟。20分钟后，小心地将用过的洗涤液倾倒至大桶中，用于临时废液储存。

加入 200 毫升冰冻的 25 毫摩尔磷酸至膜上。以此方式至少洗涤膜三次，以去除膜上的本底 γ-32P ATP 信号。第三次洗涤后，用盖革计数器检测所用洗涤液的放射性。

继续洗涤膜，直至洗脱液中无信号出现。当膜充分洗涤后，让膜短暂风干，通常需要五分钟或更短时间。在硝酸纤维素膜暴露于磷绿色染料后，按照文本方案中所述，进行Ponceau S染色和脱色的准备。

将硝酸纤维素膜短暂浸入Ponceau S染色液中1至2分钟。在脱色前，需用染色液完全润湿整个膜。然后，倒掉膜上多余的Ponceau S染色液。

用双蒸水冲洗膜，直至仅剩组氨酸激酶的条带显色。请注意，此步骤仅在所有条带均含有可检测量的蛋白质时才有效。使用剪刀将硝酸纤维素膜上的每一条带剪下。

无需完全沿着染色斑点的边缘精确切割。如果膜已充分洗涤，则因切割斑点大小不同而产生的背景可忽略不计。重要的是确保每种反应的整个斑点都被完整切下。

使用镊子将每个点样小心转移至闪烁瓶中。无需添加闪烁液，因为磷-32 可通过切伦科夫辐射直接检测。接下来，将不同稀释度的γ-32P ATP溶液点样到1厘米×1厘米的硝酸纤维素膜方块上。

使用镊子将每个方块小心转移至不含闪烁液的闪烁瓶中。这些样品将用于生成标准曲线，以确定ATP溶液每皮摩尔的每分钟计数。此处显示的是硝酸纤维素膜的Ponceau染色结果。

所有样品的染色均匀，表明各样品上样量相等。硝酸纤维素膜的荧光成像结果显示出每个点中放射性标记的磷酸化组氨酸的相对水平。第四行和第八行为阴性对照，表明过量的ATP已被从硝酸纤维素膜上洗脱。

此处展示了组氨酸激酶自磷酸化定量的代表性结果。该数据来源于对膜上每个切割下来的点进行闪烁计数。此处所示的每皮摩尔ATP对应的每分钟计数标准曲线同样由闪烁计数生成，用于计算各样本中磷酸组氨酸的皮摩尔数。

在完成此操作步骤后，可向实验中添加其他方法，例如引入假定可调节激酶活性的同源刺激物或蛋白质，以回答这些添加剂对激酶活性影响等进一步的问题。请务必注意，操作放射性物质可能具有极高危险性。在进行本操作时，必须采取适当的预防措施，包括接受正规的辐射安全培训，并使用个人防护装备和屏蔽装置。