一种优化的单分子下拉检测法用于蛋白质磷酸化定量

该SiMPull方案通过优化抗体标记和固定条件，降低绿色荧光通道中的自发荧光，并提供可靠的单分子分析算法，从而实现对蛋白质磷酸化的定量检测。SiMPull的主要优势在于能够检测单个完整蛋白质分子的磷酸化状态。利用该方法，我们可以获得通过传统技术（如蛋白质印迹和质谱分析）无法获取的新信息。

我们有一支研究人员团队协助演示该实验方案。首先，Julian Rojo 将展示如何使用piranha蚀刻盖玻片。随后，Rachel Grattan 将演示盖玻片的包被步骤。

接下来，Elizabeth Bailey 将演示如何绘制阵列和图像样本。首先，通过每五分钟轻轻摇动反应烧杯，对盖玻片进行30分钟的piranha蚀刻处理。随后，通过逐渐加入弱碱中和piranha溶液。

用玻璃棒将蚀刻的盖玻片转移至布氏漏斗中，并用双蒸水冲洗5分钟。然后将盖玻片放入玻璃染色缸中，加入甲醇覆盖。用封口膜密封盖子，并超声处理10分钟。

超声处理后，将甲醇倒入玻璃储存瓶中。用丙酮重复此步骤。在考普林瓶中用双蒸水冲洗盖玻片三次。

将盖玻片中的水分沥干，并通过在本生灯火焰上挥动使其干燥。将盖玻片放入干燥的科铂林瓶中。然后向科铂林瓶中加入氨基硅烷溶液，以对盖玻片进行氨基硅烷化处理。

盖上盖子，并用封膜密封以避光。用甲醇冲洗盖玻片，并弃去废液。再次用双蒸水冲洗盖玻片，每次两分钟，共冲洗三次。

用吸水纸吸去多余水分，并在空气中完全干燥10分钟。接着，使用疏水屏障笔绘制网格阵列。在盖玻片上标记标识符，以确定正确的方向。

墨迹干燥后，将盖玻片放入湿化室中。将153毫克mPEG和3.9毫克生物素-PEG溶于609微升10毫摩尔的碳酸氢钠溶液中，涡旋混匀。在室温下以10,000 × g离心1分钟，以去除气泡。

每平方区域加入 10 至 15 微升该溶液，完全覆盖芯片表面但避免溢出。将盖玻片置于避光的湿盒中，室温孵育 3 至 4 小时。随后将盖玻片依次浸入三个盛有重蒸水的烧杯中，每个烧杯中洗涤 10 秒。

使用氮气去除盖玻片上的所有水分。将盖玻片背对背存放于装有氮气的50毫升锥形管中，并用封口膜密封。用封口膜包裹试管，置于-20摄氏度环境中。

从冷冻环境中取出生物素-PEG功能化的阵列，使其平衡至室温。将带有阵列的一面朝上放置于已铺有密封膜的100毫米组织培养皿上。在室温下，用含10毫克/毫升硼氢化钠的PBS溶液孵育阵列的每个方格，孵育时间为4分钟。

用 PBS 洗涤三次。接着在 T50 中加入 0.2 毫克/毫升 NeutrAvidin，孵育 5 分钟，随后用 T50 BSA 洗涤三次。再在 T50 BSA 中加入 2 微克/毫升生物素标记的 POI 特异性抗体，孵育 10 分钟，随后进行洗涤。

首先，通过移液操作使裂解液解冻并混匀。取一微升裂解液，加入100微升预冷的T50 BSA PPI中进行稀释。将裂解液与芯片共同孵育10分钟，随后进行洗涤。

将AF647标记的抗磷酸化酪氨酸抗体溶于预冷的含BSA的T50 PPI缓冲液中，加入芯片，4°C孵育一小时。在物镜上滴加一滴油。将纳米网格置于载物台上进行成像。

使用透射白光，聚焦于网格图案。采集20幅网格图像，确保像素未饱和，并将图像序列保存为基准标记。使纳米网格失焦以形成艾里图案，采集20幅图像用于增益校准，并将图像保存为增益图像。

然后，通过阻挡所有进入相机的光线，获取20张用于相机偏移的图像，并将这些图像保存为背景。要获取简单的图像，首先清洁油镜并在物镜上添加额外的镜油。将盖玻片阵列固定在显微镜载物台上。

依次对每个样本进行成像，首先在远红光通道成像，然后对较短波长的荧光染料进行成像。每30至45分钟检查一次缓冲液液面，并根据需要补充。利用该技术，从总蛋白裂解液中成功捕获了EGFR-GFP。

利用疏水性墨水的自发荧光作为定位样品焦平面的参考。原始数据图像通过相机芯片上的光谱通道分离获取。进一步对绿色和远红通道的叠加图像进行分析以获取数据。

在从纳米网格获取的图像上执行了通道配准。参考标记图像的叠加显示配准不完全。通过将局部加权均值变换应用于远红和绿色通道坐标，实现了对齐，并用于后续SiMPull数据的配准。

对来自 GFP 和 AF647 通道的背景光子计数之上的单个发射源进行框选，并通过高斯定位确定其位置。通过 EGFR-GFP 与 F647 的共定位来识别磷酸化受体，共定位的百分比用于确定磷酸化受体的比例。

当使用硼氢化钠处理经食人鱼刻蚀的玻璃时，背景信号显著降低。在裂解液中观察到EGFR-GFP的稳定结合，同时PY99-AF647的非特异性结合极少，表明该方法能够有效保持表面功能化。SiMPull技术可提供有关蛋白质磷酸化的信息，并可用于研究广泛的自体信号传导问题。

这有助于加深我们对正常和疾病状态下信号传导的理解。