通过多重荧光检测染色体间稳定畸变 原位 辐射小鼠中的多重荧光原位杂交（mFISH）与光谱核型分析（SKY）

本分子细胞遗传学方法的总体目标是观察经全身照射的小鼠骨髓细胞中的染色体间稳定畸变。该方法有助于解答辐射生物学领域中的一个关键问题，即全身辐射暴露小鼠骨髓细胞中诱导产生稳定染色体畸变的风险。该技术的主要优势在于，能够实现对小鼠骨髓细胞中辐射诱导的稳定遗传损伤进行定向可视化，且此类损伤可在多代细胞分裂中持续传递。

按照文本方案从小鼠股骨和胫骨中分离骨髓并制备单细胞悬液后，小心地将细胞悬液叠加到等体积的骨髓单个核细胞分离液上。在室温下以400 × g离心30分钟。然后，小心收集中间白膜层，避免扰动其余各层，并将该溶液转移至新的15毫升离心管中。

为制备中期细胞涂片，向含有血沉棕黄层的离心管中加入10毫升磷酸盐缓冲液。然后在室温下以400 × g离心5分钟。接着，小心移除上清液，并轻轻敲击离心管以打散细胞沉淀。

然后加入 10 毫升 PBS，再次离心悬浮液。去除上清液时注意不要扰动细胞沉淀。将沉淀打散，并在轻柔且持续振荡的条件下，逐滴加入 4 毫升预热的低渗 0.075 摩尔氯化钾溶液。

将细胞悬液在37摄氏度水浴中孵育20分钟。然后向管中加入等体积的固定剂，通过轻轻颠倒管子混匀。离心管子，弃去上清液。

然后，重悬细胞沉淀并加入新鲜固定液。重复离心及添加固定液共五次。将细胞重悬于400至600微升固定液中后，取30微升固定后的细胞悬液滴加到预先清洗并润湿、倾斜45度角的载玻片上，室温静置过夜，使载玻片完全自然干燥。

进行小鼠染色体mFISH显带时，将含有中期细胞 spreads 的载玻片置于2X SSC溶液中，室温下孵育两分钟。随后，依次在70%、80%和100%乙醇中进行梯度脱水，每次乙醇处理两分钟。将40毫升变性溶液预热至70摄氏度，置于玻璃染色缸中，加热30分钟。

然后将玻片转移至预热的溶液中，孵育样本1至1.5分钟，以使染色体变性。立即用冰冻的70%乙醇淬灭玻片2分钟，以终止变性过程并防止变性的染色体重新退火。随后使用乙醇梯度进行脱水，先用80%乙醇处理2分钟。

接下来，将载玻片放入100%乙醇中处理两分钟。然后在室温下将载玻片完全干燥。为使探针变性，先短暂离心制造商提供的探针混合物，然后取10 µL转移至一个500 µL的旋盖离心管中，并将该管置于80°C水浴中孵育七分钟。

现在将含有变性探针的离心管置于37摄氏度水浴中10分钟。然后将探针混合物加到含有变性染色体的载玻片上。用18毫米×18毫米的玻璃盖玻片小心覆盖该区域，并通过非常轻柔地按压盖玻片使其与载玻片贴合，以去除任何可见的气泡。

使用橡胶胶水密封盖玻片的四个边缘，并将载玻片置于37摄氏度的湿盒中避光孵育12至16小时。杂交完成后，小心去除橡胶胶水和盖玻片，将载玻片放入预热至74摄氏度的0.4X SSC溶液中浸泡5分钟。

然后将玻片转移至洗涤液三中孵育两分钟。在玻片上加入20 µL含DAPI复染剂的抗荧光淬灭封片剂，并加盖盖玻片。用实验室纸巾轻轻按压盖玻片，以去除气泡和多余的封片剂。

然后使用指甲油密封盖玻片的边缘。使用配备适当滤光片的荧光显微镜观察载玻片。对于小鼠染色体的光谱核型分析，在探针与变性染色体杂交后，按照文本方案洗涤样本，向载玻片上加入80 µL SY5染色试剂。

将一块 24 × 60 毫米的塑料盖玻片置于样品上，于 37 °C 的湿化暗盒中孵育 40 分钟。将载玻片浸入盛有预热洗涤液的玻璃染色缸中三次，并在 45 °C 水浴中振荡孵育 2 分钟。重复洗涤三次。

向样本中加入80微升SY5.5染色试剂，盖上24×60毫米的塑料盖玻片，在37摄氏度的湿盒中避光孵育40分钟。用预热的洗涤液3洗涤玻片三次，然后将玻片倾斜靠在纸巾上以去除多余液体。向样本中加入20微升抗荧光淬灭DAPI试剂，小心地在上方加盖玻璃盖玻片，避免产生气泡。

使用指甲油封固边缘，并用配备拍摄天体图像功能的落射荧光显微镜观察样品。该图显示了具有正常和异常小鼠第1、2、3号染色体对的典型有丝分裂中期细胞铺片。此处为涉及第1号染色体的稳定型畸变，其中第1号染色体的一部分已整合到一条未标记的DAPI染色染色体中，而另一部分则形成了无着丝粒片段。

在此示例中，二号染色体的一部分已整合到未标记染色体中。这种稳定的畸变涉及三号染色体。在此中期 spreads 中，可见涉及所有三个标记染色体的稳定畸变。

此处展示的是正常雌性小鼠的光谱核型分析示例。该图显示了涉及4号和12号染色体的稳定畸变。最后，该图中的稳定染色体畸变涉及7号和10号染色体。

一旦掌握，该技术若操作得当，可在 48 至 72 小时内完成。在进行该实验时，需牢记只能使用处于增殖状态的细胞。在完成该实验后，还可结合其他方法（如染色带分析）来回答更多问题，例如受照细胞中是否存在染色体间的稳定畸变。

该技术发展之后，为分子细胞遗传学领域的研究人员探索遗传畸变与各种疾病之间的关联铺平了道路。观看本视频后，您应能更清楚地了解如何检测染色体间的稳定畸变。请注意，使用秋水仙素可能具有极高危险性，因其具有致癌性，因此在进行本实验时，必须始终采取预防措施，例如佩戴手套。