使用3D打印导板和环堆叠法制备可缩放的工程化血管移植物

本方法的总体目标是稳定且一致地构建任意尺寸的工程化血管。该技术可实现血管的可靠且高效的构建。该技术的主要优势在于能够简便且可靠地制备任意尺寸的血管。

我们最初在讨论如何构建一段组织管时萌生了该方法的想法，并将我们的方法类比为逐段建造公路隧道的过程。首先，在直径分别为35、60或100毫米的培养皿底部，分别加入一层薄薄的未固化的硅胶，体积为两、四或六毫升，以制备3D打印插件。为了制作35毫米培养板的支柱，将PDMS倒入另一个100毫米的培养皿中，使其厚度达到7毫米，然后在60摄氏度的加热板上加热2至3小时。

PDMS 固化后，使用 5 mm 活检打孔器制备圆柱形支柱。用少量未固化的 PDMS 将这些圆柱体固定在每个 35 mm 培养皿的中心。在 100 mm 培养皿中，将一个直径约为 66.7 mm 的 3D 打印外层壳体放置在距支柱等距的位置。

在60 mm和100 mm培养皿底部的PDMS固化之前，分别将直径为10 mm和20 mm的3D打印柱状结构居中放置于各培养皿中。将培养皿置于60摄氏度的加热板上，在开放空气中固化2至3小时，随后进行18小时的聚合脱气处理。脱气结束后，使用70%乙醇对所有培养皿内部进行灭菌，并加盖静置30分钟。

然后小心吸去每块培养板中的乙醇，使其自然风干。待培养板干燥后，将其转移至生物安全柜中，并将对应的盖子正面朝上放置于旁边，然后用紫外光照射30分钟以完成灭菌。

制备纤维蛋白水凝胶时，首先分别向35 mm、60 mm和100 mm培养皿中加入0.5 mL、1.1 mL和1.81 mL含有纤维蛋白凝胶和TGF-β1的生长培养基。接着，分别向35 mm、60 mm和100 mm培养皿中加入40 µL、88.4 µL和145 µL凝血酶，并用手轻轻旋转混匀各培养皿。当凝血酶均匀分布后，分别以逐滴环形方式向35 mm、60 mm和100 mm培养皿中的凝血酶培养基混合物中加入160 µL、354 µL和580 µL纤维蛋白原，然后轻轻旋转培养皿，使水凝胶均匀分布。

将水凝胶在室温下静置固化10至15分钟。随后对在150 mm细胞培养皿中扩增的靶向平滑肌细胞进行胰蛋白酶消化，并通过离心收集脱落的细胞。将细胞沉淀重悬于3 mL分化培养基中，并使用2 mL移液器剧烈吹打细胞，以充分分散任何细胞团块。

计数后，将细胞分装至50 mL锥形管中，每管细胞浓度分别为2/10 × 10⁶、1/10 × 10⁷和1.4 × 10⁷个细胞/mL，并根据对应的培养板进行标记。向每管中加入分化培养基，使最终接种体积分别为：35 mm培养板2 mL，60 mm培养板4 mL，100 mm培养板5 mL。然后，将细胞悬液逐滴小心地加入各对应培养板中已准备好的水凝胶上，置于细胞培养孵育箱中进行扩增。2至4天后，环状结构将完全向支柱方向收缩。

因此，分别向 35、60 和 100 mm 的环中加入 10、20 或 35 mL 的 TGF Beta 1。要组装 35 mm 血管结构，从 50 mL 聚碳酸酯锥形管顶部切下一段 2 英寸长的部分，并用 PDMS 胶将顶部边缘粘接到 35 mm 培养皿中，以制成用于堆叠环的高壁培养皿。对于 60 和 100 mm 血管的高壁环堆叠培养皿，将直径为 1.75 英寸的聚碳酸酯管沿长度方向切成 2.5 英寸长的段，作为高壁培养皿的侧壁。

对于较高的培养板底部，将厚度为0.125英寸的聚碳酸酯板材切割成直径为2英寸的圆形片。使用丙烯酸溶剂胶将聚碳酸酯管段粘接到圆形片上。使用3D打印技术制作直径分别为5 mm、10 mm和20 mm、长度为50 mm的柱状结构。

然后向每个容器中加入 10 mL 未固化的硅胶，在 PDMS 完全固化之前，将每个 3D 打印的支柱分别居中放置于 35、60 和 100 mm 的容器中。将培养皿置于 60 摄氏度的加热板上加热两到三小时。当 PDMS 固化后，用 70% 乙醇对培养板进行灭菌，方法如前所述，随后将干燥的乙醇灭菌容器暴露于紫外光下 30 分钟。

现在，使用两把极细的镊子，小心地将紧密卷曲的平滑肌水凝胶环从支柱上的一侧轻轻抬起，然后再抬起另一侧。接着，小心地将环的一侧滑至相应尺寸更大的下一个容器的高支柱上，然后再滑入另一侧。沿圆周方向，以轻柔渐进的动作，缓慢将环向下推入支柱，并依次堆叠额外的组织环，直至达到所需的血管长度。

当所有环状结构堆叠完毕后，将培养板旋转至支柱与工作台面平行，同时在缓慢旋转培养板的同时，分别向直径为 35、60 和 100 mm 的每个血管结构的外表面轻柔地加入 40、80 和 160 微升的凝血酶（Thrombin）。接着，在快速旋转血管结构的同时，尽可能迅速且均匀地分别向直径为 35、60 和 100 mm 的每个构建体中加入 40、80 和 160 微升的纤维蛋白原（Fibrinogen）。凝血酶与纤维蛋白原混合后将迅速形成坚固的凝胶。

然后向每个构建物容器中加入 20 mL 分化培养基，并将容器置于 37 °C 培养箱中备用。组织学分析显示，所有环状结构均具有较高的细胞密度，小环外缘可见少量残留的纤维蛋白凝胶。在较大的环状结构中，部分纤维蛋白凝胶与细胞成分交错分布，且在中等和大环中均可见明显的胶原蛋白生成迹象。

对α-平滑肌肌动蛋白和原肌球蛋白表达的组织环分析显示，所有环状结构尺寸均对两种抗体呈阳性，证实平滑肌表型得以维持。拉伸强度测试表明，三种不同尺寸的环状结构均呈现出环和血管尺寸增大、强度相应增加的一致趋势。用于构建不同环状结构的细胞接种数量也与接种表面积相一致。

这些血管结构在与灌注系统连接处仅有轻微渗漏的情况下，能够承受 100 至 417 毫升/分钟流速的流动，持续时间可达五分钟。只要操作得当，掌握该技术后可在一小时内完成环状结构的构建。在进行该操作时，需特别注意充分混匀水凝胶组分，以确保凝胶充分固化并形成结构完整的环状物。

通过该方法，还可采用类似技术构建其他类型细胞的环状结构，用于工程化不同类型的组织。观看本视频后，您应能够充分掌握如何利用环状堆叠法构建不同尺寸的血管组织。