培养昆虫细胞中重组蛋白的瞬时表达与细胞定位

本实验的总体目标是在市售昆虫细胞中表达带有荧光标记的目的蛋白，以更清晰地阐明蛋白功能及/或细胞内蛋白的转运过程。该方法有助于解答有关蛋白功能、蛋白相互作用及/或蛋白亚细胞定位等关键的细胞生物学和生物化学问题。该技术的主要优势在于，可在无需使用杆状病毒表达系统的情况下，快速构建表达载体并在活细胞中对表达的蛋白进行功能性评估，避免了与杆状病毒表达相关的不利影响，从而提高实验通量。

尽管该方法可为昆虫蛋白质的研究提供见解，但也可应用于任何需要研究蛋白质功能或细胞定位的系统。我实验室的技术员Danni LeRoy将演示昆虫细胞培养与转染的操作流程。开始该操作时，从-80摄氏度冰箱中取出冻存的SF9和Tni细胞小瓶，置于37摄氏度水浴中使其解冻。

解冻后，用70%乙醇对冻存管进行去污染处理，并将其置于冰上。所有需要打开冻存管和组织培养瓶的操作都必须在超净工作台内进行，以维持无菌条件。向一个新的T25培养瓶中加入4 mL无血清昆虫细胞培养基，向另一个T25培养瓶中加入4 mL TNM-FH培养基。

将1毫升解冻的Tni细胞转移至含有无血清昆虫培养基的培养瓶中，将1毫升解冻的SF9细胞转移至含有TNM-FH培养基的培养瓶中。将培养瓶置于28°C非湿润培养箱中，使细胞贴壁30至45分钟。随后用5毫升相应的培养基替换接种培养基。

将培养瓶放回28摄氏度非湿化培养箱中。每日监测细胞汇合度。当细胞达到90%汇合度时进行传代，如这些代表性图像所示。

将含有融合细胞的培养瓶倾斜，使培养基流向远离细胞单层的一角，然后使用无菌的5毫升血清移液管小心地移除培养基，避免扰动细胞。对于Tni细胞，使用新的无菌5毫升血清移液管，轻轻将4毫升无血清昆虫培养基加入融合的单层细胞中。移动移液管尖端，使其在培养瓶内移动，并缓慢冲洗，以去除松散附着在培养瓶底部的细胞。

为检查细胞是否充分脱落，移除所有培养基，将培养瓶倒置，观察培养瓶底部是否变得透明。对于贴壁更紧密的SF9细胞，加入4 mL新鲜TNM-FH培养基，并使用细胞刮刀刮下贴壁细胞。用5 mL血清移液管轻轻吹打以混匀细胞，减少细胞团块。

消化细胞后，将每种细胞与培养基的混合物约 0.1 毫升转移至一个 1.5 毫升的微量离心管中。另取一个 0.5 毫升的微量离心管，向其中加入 10 微升每种细胞与培养基的混合物和 10 微升台盼蓝染液。从包装中取出细胞计数板，将 10 微升细胞培养基与台盼蓝的混合液分别加入计数板两侧的加样区。

将玻片插入自动细胞计数仪，测定细胞密度和活率。将约1×10⁶至1.5×10⁶个细胞转移至含有新鲜培养基的T25培养瓶中。在培养瓶上标记细胞系名称、日期、所用培养基、接种细胞数量及传代次数。

将锥形瓶置于28摄氏度的培养箱中，培养时间最长可达72小时。昆虫细胞转染操作也必须在层流罩内进行。在适当的昆虫细胞培养基中，接种最多1 × 10⁶个Tni或SF9细胞至T25培养瓶中。

本实验中使用Tni细胞。将细胞在18摄氏度下培养72小时至完全汇合。72小时后，移除并弃去旧培养基，并如前所述用4毫升新鲜无血清昆虫培养基悬浮Tni细胞。

该实验操作中最困难的部分是在转染过程中获得附着于玻璃底培养皿上合适密度的细胞。每个培养皿中加入的细胞数量不应超过 7 × 10⁵ 个。使用自动细胞计数仪估算细胞密度后，通过轻轻翻转离心管充分而轻柔地混匀细胞悬液，并向各个 35 毫米玻璃底培养皿中加入约 7 × 10⁵ 个细胞。

在28摄氏度下孵育20至25分钟，使细胞贴壁。每份转染样品，在无菌的1.5毫升微量离心管中，将2微克质粒DNA加入0.1毫升不含FBS的无血清昆虫细胞培养基中。在另一管中，将8微升转染试剂与0.1毫升无血清昆虫细胞培养基混合。

然后将溶液转移至含有目的质粒DNA的离心管中。轻轻涡旋混匀，并在室温下孵育20至30分钟。接着，用0.8毫升无血清昆虫细胞培养基稀释质粒转染混合物，使总体积达到1毫升。

小心移除含有贴壁细胞的玻璃培养皿中的培养基，加入稀释后的质粒转染培养基覆盖贴壁细胞。在 28 摄氏度下孵育细胞 5 小时。

转染5小时后，移除并弃去转染培养基，用1毫升无血清昆虫细胞培养基轻轻洗涤细胞，注意避免细胞脱落。加入2毫升新鲜的无血清昆虫细胞培养基，在28摄氏度下培养48至72小时。昆虫细胞转染后48至72小时，用1毫升IPL-41昆虫细胞培养基洗涤细胞一次，然后加入2毫升IPL-41培养基覆盖细胞，用于成像。

向培养基中加入四滴 Hoechst 活细胞染色试剂，在 28 摄氏度下孵育 20 至 25 分钟。将 35 毫米培养皿放入自带封闭系统的激光扫描共聚焦显微镜中。尽管市面上有多种玻璃培养皿可供选择，但重要的是确保其适配显微镜载物台，可能需要通过实验确定哪种器皿最有利于细胞贴附。

调整显微镜以满足Hoechst、EGFP和mCherry的观察条件。Hoechst的激发波长为359纳米，发射波长为461纳米；EGFP的激发波长为489纳米，发射波长为510纳米。

mCherry 的激发波长为 580 纳米，发射波长为 610 纳米。使用 10X 物镜进行初步扫描，以确认荧光表达。随后，切换至 60X 相差水浸物镜，进入扫描模式。

调节激光功率、检测器灵敏度、扫描速度、Z轴深度和数字放大倍数，以优化图像对比度和分辨率。以1.5倍数字放大倍数对细胞成像，总放大倍数为90倍。将原始数据保存并导出为TIFF图像文件，用于后续分析。

Tni细胞被转染了指定的质粒，并通过共聚焦荧光显微镜观察重组蛋白的表达。重组BtDrip1-EGFP成功转染和表达的证据是细胞表面存在绿色荧光。转染了BtDrip2版本一EGFP的细胞显示内部有绿色荧光，表明BtDrip2版本一在细胞内表达。

同样，转染了PIB DmSPR-mCherry或PIB PLA2G15-mCherry的细胞显示出红色荧光，表明相应融合蛋白的表达。在合并图像中，橙色或黄色区域表示EGFP和mCherry同时表达，提示这些蛋白共定位于相同的亚细胞结构中。对共转染PIB BtDrip1-EGFP和PIB DmSPR-mCherry的细胞进行叠加成像，表明BtDrip1-EGFP与DmSPR-mCherry在细胞表面存在共定位。

共转染了BtDrip2版本一EGFP和PIB DmSPR-mCherry的细胞中，绿色和红色荧光信号的共定位较少，证实了BtDrip2版本一的细胞内表达。相反，共表达PIB BtDrip2版本一EGFP和溶酶体标记PIB PLA2G15-mCherry时，细胞质中的绿色和红色荧光信号显示出显著重叠。这强烈提示BtDrip2被运输至细胞内溶酶体。

观看本视频后，您应能够充分理解如何在培养的昆虫细胞中表达荧光蛋白融合体。该系统可实现蛋白质合成中的快速载体构建，避免了基于病毒表达系统的难题，并为观察细胞内蛋白质转运提供了可靠手段。