一种用于血清学检测抗原特异性抗体应答的蛋白质微阵列实验方法 艰难梭菌 感染

该方法可能有助于以个体化的方式优化并选择针对艰难梭菌感染的临床适用性免疫疗法，并阐明人体对艰难梭菌的免疫应答。该技术的主要优势在于能够准确且同时定量检测针对艰难梭菌抗原的多种同种型及菌株特异性抗体应答。通常，初学者在应用该方法时会遇到困难，因为需要具备建立和优化一组高纯度抗原的技术专长，并搭建相应的技术平台。

该方法的可视化演示至关重要，因为在制备微波板、阵列打印、安全操作以及数据分析等方法学步骤中，每一个细节都需要特别注意。部分实验操作将由本实验室的技术员 Sam Greenwood 进行示范。首先，将艰难梭菌抗原和打印缓冲液稀释至最佳浓度。

接下来，将10微升抗原溶液转移至384孔板中。用封板膜封住板孔，在室温下以300 × g离心5分钟。进行微阵列点样时，使用手持式气体燃烧器对硅质PIN针进行三次加热，每次2秒。

然后，用洁净水冲洗硅PIN芯片，每次三秒，共冲洗三次。将微阵列板放入点样仪的加载卡匣中。推出托盘，将氨基硅烷包被的载玻片放入载片托盘中，按下“确定”按钮以启动真空。

确保所有载玻片均已固定，然后单击“确定”。将载玻片托盘移回原位，并盖上盖子。接下来，启动相应程序，进入“文件”菜单，选择“微阵列参数”，然后点击“打开”。选择艰难梭菌文件，以四重复方式打印所有抗原。

在此窗口下方，打开“源”选项卡以指定样本存储信息，打开“目标”选项卡以输入微阵列详细信息。然后，打开“选项”选项卡以选择洗涤工具。在运行偏好设置的“常规”选项卡中，于 TAS 应用程序套件工具栏上，选择“运行开始时洗涤”和“运行结束时洗涤”。

打开气候设置选项卡，将湿度水平设定在55%至60%之间。现在启动运行，并定期检查点样仪以确保其正常工作。打印完成后，将打印好的载玻片小心地放入具有16个多个孔室的载玻片架中。然后向每个区域加入100微升5%BSAT溶液。

盖上盖片，在室温下振荡孵育一小时。用 120 微升 PBST 振荡洗涤每个样本，每次一分钟，共洗涤五次。接下来，将来自艰难梭菌感染患者和健康对照者的血清样本置于冰上解冻 20 分钟。

向主阻断液中加入市售的抗体稀释液，然后将样品加入主阻断液中并混匀。弃去洗涤缓冲液，向各实验孔中加入100 µL稀释后的样品。对于阴性对照孔，仅加入100 µL抗体稀释液。

然后，将切片在室温下轻轻振荡孵育1小时。接着，用120微升PBST缓冲液振荡洗涤每个区域，每次3分钟，共洗涤5次。然后，向每个区域加入100微升用抗体稀释液稀释的生物素化山羊抗人抗体。

盖上盖玻片，在室温下轻轻振荡孵育一小时。用 120 微升 PBST 缓冲液，在振荡条件下，每块组织洗涤 5 次，每次 3 分钟。随后，将链霉亲和素 SY5 偶联物以 1:2000 的比例用 5%BSAT 稀释，每块组织加入 100 微升。

用锡箔纸覆盖载玻片，并在室温下轻轻振荡孵育15分钟。首先用120微升PBST缓冲液洗涤载玻片，每次1分钟，共洗5次；随后再用PBS缓冲液洗涤2次，每次1分钟。为干燥载玻片，以300 × g离心5分钟。

在扫描前30分钟打开激光扫描仪，使其预热。然后将载玻片放入扫描仪中，印刷面朝上，直至面板指示灯变为稳定的绿色。接着，按下“设置”按钮。

在第一个选项卡中，确保取消勾选自动滚动和条形码选项。然后，将像素大小设置为10，扫描模式设置为中等，采集波长设置为仅635，采集模式设置为手动，增益设置为20，功率设置为低。在第二个选项卡中，确保载玻片类型为未标记。

在第三个选项卡中，将对焦设置设为自动对焦。按下导入网格按钮，选择与扫描图像相关联的适当阵列列表。然后，按下自动查找按钮，将网格与玻片上的点对齐。

最后，按下“定量分析”按钮以测量每个点的荧光强度，然后将结果保存为适当的格式以供进一步分析。在本实验方案中，通过与酶联免疫吸附测定（ELISA）进行比较，评估蛋白微阵列与该技术之间的重复性。

斯皮尔曼相关系数分析显示，蛋白微阵列与ELISA在检测血清样本中抗毒素A IgG和抗毒素B IgG水平方面具有显著的一致性。通过七名患者的血清样本计算蛋白微阵列的板内和板间重复性。针对毒素A、毒素B、SLP001、SLP002、SLP027、仅产毒素B菌株CCUG来源的毒素B以及pCDTb抗原，在两张不同的微阵列玻片上对样本进行分析，结果表明该方法具有良好的重复性。

通过蛋白质微阵列检测针对艰难梭菌毒素的同种型特异性抗体反应。利用患者和健康个体的血清样本，检测针对毒素A、毒素B、仅表达艰难梭菌毒素B菌株产生的毒素B，以及二元毒素B片段前体形式的IgG和IgA水平。掌握该技术后，可在七小时内完成实验。

在进行质量控制实验之前，应评估不同的参数，例如适当表面化学的选择、打印缓冲液、封闭缓冲液，以及血清样本和二抗的稀释度。要打印出高质量的芯片，需要充分了解芯片或相关软件，以便根据实验方案调整参数设置。在整个实验过程中，保持点样仪的最佳性能以及无尘环境至关重要。

该技术将为免疫学和分子生物学领域的研究人员表征感染引起的体液免疫反应以及发现血清学诊断抗原提供重要途径。请勿忽视，操作感染性血液样本和细菌毒素可能存在生物安全风险。通常情况下，在实验室进行本实验操作时，必须始终考虑安全性和标准防护措施。