样本制备、成像与刀锋扫描显微镜分析方案

本实验的总体目标是演示如何制备生物样本，以便在刀片边缘扫描显微镜（KESM）下进行切片和成像，并可视化所获得的图像堆叠数据。该过程首先通过固定、染色和包埋组织，使其适用于KESM成像；第二步是配置KESM系统，并利用自动化控制软件进行切片与成像操作。

随后对获得的图像进行去噪、配准和裁剪。最后一步是在基于网络的图谱和三维可视化软件中加载并浏览数据集。最终可获得能够显示全脑水平下亚微米分辨率的神经元和血管结构的结果。

与现有的介观成像技术（如连续块面扫描电子显微镜）相比，该技术的主要优势在于能够对更大体积的样本进行成像，尽管分辨率相对较低。该方法有助于回答连接组学及神经科学领域中的关键问题。此技术可揭示大脑的结构组织特征，同时也可应用于肺、肾等其他器官系统。

开始此操作时，将解剖得到的小鼠脑组织放入含有高尔基-考克斯溶液的玻璃瓶中。将玻璃瓶置于避光盒内，在室温下放置10至16周。由于高尔基-考克斯溶液本身具有固定作用，因此无需单独进行固定步骤。

10至16周后，于次日在避光条件下用去离子水浸泡脑组织过夜。随后将清洗后的脑组织置于含5%氢氧化铵的去离子水溶液中，在室温避光环境下浸泡7至10天。7至10天后，在室温下用去离子水再次清洗脑组织4小时。然后通过梯度乙醇溶液对脑组织进行脱水处理，每种浓度溶液中放置24小时，分别为4°C下的50%乙醇、70%乙醇和85%乙醇。

在室温下用95%乙醇换液三次，再用100%乙醇换液四到五次。接着将脱水后的脑组织置于丙酮中，每天更换一次，共更换三到四次。此后，将脑组织依次置于冰箱中过夜，分别使用aite与丙酮比例为1:2、1:1和2:1的aite-丙酮混合液。

最后将脑组织置于100% aite中，放入冰箱，每次过夜更换一次，共更换三次。处理后的脑组织随后包埋于100% aite中，并在60摄氏度下加热三天。最后，将固化好的样本块用环氧树脂固定在金属样本环上，并根据需要修整样本块的侧面，以开始此操作步骤。

确认小鼠已深度麻醉，且对脚趾挤压无反应。随后，使用室温磷酸盐缓冲盐水经心脏灌注小鼠，接着灌注冷的含4%磷酸盐缓冲的多聚甲醛。然后，用0.1%硫堇染料溶于去离子水的溶液对小鼠进行灌注。

之后，将尸体置于 4 °C 冰箱中保存 24 小时。24 小时后，取出大脑，放入新鲜的 0.1% 硫堇溶液中，并在 4 °C 下保存 7 天。

七天后，通过梯度乙醇系列对脑组织进行固定和脱水。在六周的时间内，依次在50%乙醇中放置3至5天，70%乙醇中7至10天，85%和95%乙醇中各约两周，其余时间置于100%乙醇中。在室温下用丙酮更换三次后，将脑组织包埋于环氧树脂塑料中，并置于60摄氏度烘箱内聚合。

开始使用印度墨水对血管网络进行染色时，首先通过观察小鼠是否缺乏足趾回缩反射来确认其已处于深度麻醉状态。随后，经心脏灌注室温的磷酸盐缓冲盐水，接着灌注室温的10%中性缓冲甲醛。通过全身灌注盐水和固定液，可清除心血管系统中的血液并固定组织。

接下来，用 3.0 ccs 未稀释的印度墨水对小鼠进行灌注。使用印度墨水是为了完全填充心血管系统的血管网络。从小鼠体内取出脑组织后，将其通过一系列梯度乙醇脱水，然后包埋于环氧树脂塑料中。

按照之前展示的KESM成像设置步骤，打开相机、照明光源和载物台，升起刀片和物镜。接着安装样品环。然后降低物镜和刀片。

测量样本尺寸，然后为KESM切片机控制器创建配置文件。在初始化切片机之前，需运行两个应用程序，分别将KESM的刀片和物镜抬起。

启动KESM阶段控制器二并初始化载物台。然后降低刀片和物镜，并打开泵。通过旋转光学系统上的调焦旋钮，并调整相机相对于刀片边缘的视野，来对物镜和相机进行对焦。

单击，逐步检查成像和切片的前几个步骤，然后单击“开始”，以启动成像和切片，用于图像处理。

运行 KESM 图像栈处理器，以去除光照伪影并标准化所有图像的背景强度。对所有数据子文件夹重复此操作。要使用 KESM 脑图谱可视化数据，请访问此网站并选择相应的图谱以进入不同的深度。

从下拉菜单中选择每步移动的深度，然后点击加号以增加或点击减号以减小Z轴深度。其他选项包括使用KESM脑图谱进行放大或导航。使用下拉菜单调整叠加层数量和叠加间隔，以通过VIS实验室工具可视化数据。

启动应用程序，创建一个新项目。该项目应包含从二维文件生成三维、设置世界矩阵算术为一，以及查看三维连接。按此顺序，在按下鼠标右键的同时，应在查看三维界面中设置相应的参数。

移动鼠标可调整阈值，以裁剪相应区域。当方向改变、照明条件改变或背景开启与关闭时，均可进行调整。以下视频片段展示了具有代表性的KESM结果，首先显示的是KESM的体可视化图像，即用于血管数据集的全脑印度墨水数据堆栈，起始部分为血管数据的特写，宽度约为100微米。

这段KESM全脑印度墨水数据的第二段视频展示了小鼠全脑血管系统的三个标准视角，数据来源于高分辨率图像，宽度约为10毫米。包括矢状面视图、冠状面视图和水平面视图，以及沿冠状面切片的穿行动画。KESM。本视频片段展示了小鼠全脑高尔基染色数据，沿三个不同切片平面进行穿行演示，依次呈现组织块整体视图、矢状面视图、冠状面视图和水平面视图。

接下来展示的是小鼠全脑KESM GoGy数据的更多细节。第一个视频片段显示了小脑和浦肯野细胞。第二个片段展示了大脑皮层和顶内侧细胞。

最后是KESM。这两个视频片段展示了全脑nle数据。首先显示的是NLE数据的特写。

此第二个视频展示了从小鼠全脑 Nle 数据中从高分辨率数据下采样得到的三个标准视图。此外，还显示了一个横截面，以清晰呈现发育后内部结构。该技术为神经科学领域的研究人员探索小鼠大脑中的神经元和血管网络铺平了道路。

观看本视频后，您应能够充分理解刀刃扫描显微镜的样品制备、成像及数据分析。