应用基因编码的荧光一氧化氮（NO•）探针geNOps对单细胞中NO•信号进行实时成像

本成像方法的总体目标是利用一类新型的基因编码荧光一氧化氮探针（geNOps），在单细胞水平上实时监测一氧化氮信号。鉴于一氧化氮在生物学和生理学中的重要性，自其被发现以来，人们一直希望能够在细胞甚至亚细胞水平上实现对该分子的可视化。我们使用一类新型且结构相对简单的基于荧光蛋白的探针——geNOps，来实现一氧化氮信号的可视化。

geNOps 可通过荧光淬灭直接且立即响应一氧化氮。这意味着您可以监测单个细胞中一氧化氮生成、扩散和降解的实时动力学过程。geNOps 的主要优势在于，利用常规荧光显微镜即可实现对一氧化氮信号的高时空分辨率观测。

开始此操作时，将内皮细胞系或 HEK293 细胞的保存缓冲液更换为每孔 1 毫升的二价铁增强溶液，于室温下进行。在完全避光条件下孵育细胞，精确孵育 20 分钟。铁离子负载步骤对于获得探针的完全响应性至关重要，且可根据不同细胞类型和应用进行相应调整。

随后，用储存缓冲液洗涤细胞一次，并在每个孔中加入两毫升储存缓冲液，于室温下孵育至少两小时，使细胞达到平衡状态。然后，将储存缓冲液替换为含3.3 µM Fura-2AM的缓冲液（溶于一毫升储存缓冲液中）。避光保护细胞，并孵育45分钟。

孵育45分钟后，用储存缓冲液洗涤细胞两次，再将细胞于储存缓冲液中孵育至少30分钟，以使细胞达到平衡状态。开始实验时，首先将一片直径30毫米、包被有内皮细胞系或HEK293细胞的盖玻片固定在金属灌流 chamber 中。打开成像系统，然后将金属灌流 chamber 置于显微镜载物台上。

将流入管连接至缓冲液储液槽，然后启动灌流系统。接着将流出管连接至真空泵，确保灌流稳定并避免盖玻片上的液体流失。使用半自动灌流系统，以含生理浓度钙离子的缓冲液开始重力驱动的灌流。

然后，使用相应的软件设定成像参数。选择340纳米和380纳米的激发波长用于Fura-2成像，480纳米的激发波长用于激发G-geNOp。接下来，通过移动显微镜的xyz载物台，直至多个荧光细胞处于焦平面，从而选定成像区域。

然后，定义感兴趣区域。在每个成像视野中，绘制覆盖多个完整单个荧光细胞的区域。接着，定义一个大小相似的背景区域。

在配备电动样品台和单色光源的倒置高级荧光显微镜上开始采集数据。或者，分别在340纳米和380纳米波长下激发Fura-2AM，在480纳米波长下激发G-geNOp。设置相应的曝光时间，以便随时间推移在所有通道中均可检测到清晰的荧光信号。

使用配备适当滤光片组（包括500纳米激发滤光片、495纳米二向色镜和510–520纳米发射滤光片）的CCD相机，分别在510纳米处收集Fura-2AM的发射光，在520纳米处收集G-geNOp的发射光。然后每三秒记录一帧图像。首先在生理钙缓冲液中记录前三分钟，以获得相应荧光信号的基线值。

当观察到稳定的基线荧光后，切换至含有100微摩尔组胺或ATP的生理钙缓冲液，刺激细胞3分钟。随后，换回不含组胺或ATP以及L-NNA的生理钙缓冲液，灌流5分钟以清除细胞中的化合物。之后，通过灌流系统在生理钙缓冲液中加入10微摩尔NOC-7，持续给药2分钟。

一氧化氮供体对G-geNOp荧光有显著影响，通常在10微摩尔NOC-7作用下，细胞荧光强度降低超过20%。在EA.hy926细胞中，NOC-7引起的G-geNOp荧光淬灭效应强于激动剂诱导的荧光淬灭。随后，用生理钙缓冲液洗涤约10分钟以清除释放一氧化氮的化合物，并在基础荧光恢复后停止记录。

图中显示的是表达 G-geNOp 并加载了 Fura-2AM 的 EA.hy926 细胞的代表性宽场荧光图像。此处显示的是在 100 微摩尔组胺刺激下，Fura-2 与 G-geNOp 信号同步记录的代表性时间过程。如图所示，使用灌流系统在三分钟后去除了组胺。

这些曲线代表了一个负载Fura-2AM并瞬时表达G-geNOp的单个内皮细胞中胞质钙离子和一氧化氮信号的同时记录结果。细胞在含钙缓冲液中用100 µM组胺刺激三分钟。此处显示的是经500 µM L-NNA预处理后的EA.hy926细胞在测量期间钙离子和一氧化氮信号随时间变化的代表性同步记录结果。

细胞在含有2毫摩尔钙的条件下用100微摩尔组胺处理。该图显示了细胞质内一氧化氮信号的平均曲线，其响应依次为1微摩尔ATP刺激和随后的100微摩尔ATP二次细胞刺激。一旦掌握，该技术可让你以最少的操作实现实时观察一氧化氮信号。

我认为，这项技术将为研究人员探索和重新研究一氧化氮在各种细胞模型中的信号通路铺平道路。观看本视频后，您应能充分掌握如何在您的模型系统中利用geNOps技术实现一氧化氮的实时成像。