用于大规模制造细胞球体的三维声学组装装置

类器官球等三维和虚拟培养模型已广泛应用于基因工程、延迟建模以及常规筛选等领域。本研究致力于开发一种先进的工程化方法，以制备高质量的类器官球或其他三维和虚拟培养模型，用于多种生物学研究。在本实验方案中，类器官球在JAMA支架内生长，最终通过溶解支架获得，此过程增加了额外的操作步骤。

我们将尝试在培养基中利用声波将细胞聚集体进行声学组装，使其无需支架即可在类球体中生长。与磁力组装技术相比，声波能够直接、无需人工干预地组装细胞，且对细胞无潜在毒性作用。此外，我们的实验方案可实现细胞类球体在三维阵列中的组装，显著提高了通量。

首先，用75%酒精对声学装置的腔室进行五分钟的消毒，然后用无菌PBS清洗装置，并用紫外光照射一小时。将无菌的声学装置固定在显微镜载物台上，以便从顶部观察腔室内部。将数字显微镜置于未安装PZT换能器的一侧，以实现对腔室内部的侧向观察。

将三个PZT换能器的导线分别独立地串联连接至三个功率放大器和函数发生器的三个输出通道。在函数发生器上为每个PZT换能器编程设置参数，包括正弦波形、频率和振幅。在T25细胞培养瓶中，使用添加10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的DMEM培养基培养3CA细胞。

当细胞融合度达到80%时，用PBS洗涤培养物两次。移除PBS后，向培养瓶中加入2毫升0.05%胰蛋白酶-EDTA，于37摄氏度孵育以使细胞脱落。向培养瓶中加入2毫升完全细胞培养基以终止胰蛋白酶消化作用。

将细胞悬液转移至15毫升离心管中，在200 G条件下离心5分钟。为制备生物墨水溶液，将适量C3A细胞悬液与灭菌的GelMA溶液混合。用2微摩尔的细胞示踪剂溶液在37摄氏度下对C3A细胞球进行预染色，持续20分钟。

洗涤细胞时，首先通过离心去除上清液，然后加入新鲜的细胞培养基。将至少两毫升的生物墨水加入已灭菌的声学装置腔室中。打开信号发生器和功率放大器，以启动每个PZT换能器的驱动，从而形成三维细胞聚集体阵列。

使用蓝光照射生物墨水30秒以交联，形成包埋声学组装细胞聚集体的三维水凝胶支架。随后，小心地将三维水凝胶支架从腔室转移至培养皿中，用洁净的刀片将其切成小块，然后向培养皿中加入细胞培养基。

将C3A细胞球体在含有1 µL钙黄绿素AM和2 µL碘化丙啶的1 mL PBS中，于37°C孵育15分钟，分别在不同的培养时间点进行处理。用PBS将包埋在水凝胶支架中的样品冲洗两次。对于回收的细胞球体，以200 ×g离心5分钟，并用PBS洗涤两次。

使用荧光显微镜观察类球体并采集图像。细胞聚集体呈规则的三维点阵排列，并显示绿色荧光信号。组装的C3A GelMA聚集体在第3天逐渐融合，形成紧密的类球体，同时类球体直径增大。

细胞球在培养的前三天内保持良好的活力，但在培养一周后活力略有下降。释放的细胞球保持了良好的球形形态，尺寸分布均匀，且具有理想的活力和白蛋白表达。