Protocol for the Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells into Mixed Cultures of Neurons and Glia for Neurotoxicity Testing

该程序的总体目标是将源自人诱导多能干细胞集落的神经干细胞分化为神经元和神经胶质细胞的混合培养物。该模型适用于药物和化学毒性筛选。该体外模型可用于评估在神经元和神经胶质细胞分化过程中被激活的信号通路的化学诱导扰动。

该系统的主要优点是使用源自诱导多能干细胞的人体模型，该模型代表了传统使用的癌细胞和动物原代培养物的替代品，并允许研究神经元和神经胶质细胞混合群体中的神经毒性。该程序将由我们的博士后 Francesca Pistollato 和我们实验室的研究生 Carolina Nunes 进行演示。首先传代 hiPSC 集落。

在层流柜中以 4 X 放大倍率的立体显微镜下工作，使用带有 30 号针头的 1 毫升注射器。将干细胞集落切成约 200 微米 x 200 微米的正方形。切开菌落需要良好的手工技能才能获得相同大小的片段。

使用市售的切割工具会有所帮助。然后使用 200 微升移液器轻轻移液下面的介质以提起碎片，从而将菌落碎片从培养皿表面分离。将 100 个左右的菌落片段转移到合格的基质 DMEM F12 包被的 60 毫米培养皿中，该培养皿中填充有 4 mL 完全 hiPSC 培养基。

然后在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育新培养皿。每天更换总培养基，并使用相差显微镜以 4 X 和 10 X 放大倍数检查菌落的形态。在分化程序的第 0 天，通过每 60 毫米培养皿添加 3 毫升培养基来刷新 hiPSC 培养基。

然后像以前一样切割并分离 200 微米的片段。将分离的片段和培养基移液到 15 毫升试管中。用 2 毫升完全 hiPSC 培养基冲洗培养皿并回收所有片段。

然后以 112 倍 G 离心 1 分钟。离心后，吸出上清液，并将片段轻轻重悬于 5 mL 完全 hiPSC EB 培养基中。将全体积接种在 60 毫米超低附着组织培养皿中。

将培养皿在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育过夜。第二天用倒置显微镜检查细胞。第一天的胚状体应该看起来是圆形的，并且彼此不同，如图所示。

然后从培养皿中吸取胚状体和培养基，并转移到 15 毫升试管中。将胚状体以 112 倍 G 离心 1 分钟。第二天，从先前制备的 60 毫米培养皿中吸出标准基质涂层溶液，并向培养皿中加入 5 毫升完全神经上皮诱导培养基或 NRI。

在立体显微镜下以 4 X 放大倍率使用 200 微升移液器，收集大约 50 个漂浮的胚状体并转移到一个涂层培养皿中。然后在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育培养皿。第二天，即分化程序的第三天，在显微镜下以 10 倍放大倍率检查培养皿，以确保胚状体都已连接

然后用完全 NRI 培养基轻轻更换总培养基。每隔一天更换一次 NRI 培养基，直到第 7 天，此时应该可以看到玫瑰花结样神经上皮聚集体。第 7 天，将 100 μL 用培养基稀释的标准基质移液到每个孔中，包被 96 孔板。

第 8 天，在无菌条件下，在立体显微镜下以 10 倍放大倍数将莲座状聚集体切成碎片。请注意，当用针头接触时，玫瑰花结往往很容易从培养皿上脱落。在这种情况下，用针尖部分解聚分离的玫瑰花结。

如果玫瑰花结仍部分附着，请使用 200 微升移液器完成玫瑰花结片段的分离。莲座花结切割需要良好的手工技能和精度，以避免切割无神经外胚层衍生物。接下来，将玫瑰花结片段及其培养基收集到 15 毫升锥形管中。

用 2 毫升 NRI 培养基冲洗培养皿以回收所有片段。然后以 112 倍 G 的速度旋转玫瑰花结片段 1 或 2 分钟。吸出上清液后，将沉淀轻轻重悬于 1 毫升预热的 1 X DPBS 中，不含钙和镁。

轻轻地上下移液莲座片段以部分解离它们。然后加入 4 毫升完全 NRI 培养基，并使用台盼蓝和自动细胞计数仪对细胞进行计数。接下来从 96 孔板中吸出标准基质包被溶液，并在 NRI 培养基中以每平方厘米约 15， 000 个细胞的密度将细胞沉积到孔中。

将板在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育过夜。第 10 天，使用完全神经元分化培养基进行总培养基更换。这张代表性图像显示了体外 12 天后的莲座丛，巢蛋白为绿色，β 3 微管蛋白为红色。

在这里，已在体外生长 28 天的细胞已对红色的 β 3 微管蛋白和绿色的 NF200 进行了染色。这张代表性图像显示了 21 天后从 NSC 分化的神经元细胞，红色为 NF200 染色，绿色为 TOW。在这里，来自相同培养物的神经胶质细胞以红色对 GFAP 进行染色。

该直方图比较了 IMR90 hiPSC 衍生物和从 IMR90 hiPSC 衍生的 NSC 分化的细胞中巢蛋白、MAP 二、GFAP、γ-氨基丁酸、囊泡谷氨酸转运蛋白一和酪氨酸羟化酶阳性细胞的定量。这些使用 10 倍物镜拍摄的相差图像显示神经元干细胞分化了 21 天。通过遵循这些程序，可以进行其他读数，例如定量实时 PCR 和多边再分析，以评估神经元和神经胶质细胞的生理学和表型，并评估化学物质的效果。

不要忘记，使用化合物可能非常危险。这就是为什么在气流罩下应始终使用护目镜、手套或面罩采取相关预防措施，尤其是在进行化学处理时。看完这个视频后，你应该对如何从人诱导的多能干细胞开始获得神经元和神经胶质细胞的混合分化群体，这代表了适合开发神经毒性测试的模型，体外模型。