人多能干细胞来源神经元的分化后重接种，用于神经突起形成和突触成熟的高内涵筛选

本方案促进了人多能干细胞来源的神经元在高内涵筛选应用中的使用。该方法特别适用于检测突触，因为人神经元中的突触需要长时间的培养才能形成。我们展示了将神经元从大规格培养皿重铺至适用于高内涵筛选的多孔板中的方法，该过程可有效维持神经元的存活率。

出乎意料的是，我们发现，在重悬和重新接种细胞之前延长蛋白酶孵育时间，反而能提高神经元的存活率。由人多能干细胞衍生而来的神经元在基础研究、药物开发和退行性疾病治疗领域正变得日益重要。这种温和的滴定方法可用于重悬任何具有密集突起网络的大型单层细胞。

除了人iPSCs外，该方法还可用于原代神经元的传代培养，或将其重悬用于流式分选或单细胞测序。必须严格遵循操作步骤，并持续监测蛋白酶介导的神经元从培养板上的解离过程。最佳孵育时间可能因培养条件不同而有所差异。

通过直观演示，即使是没有经验的研究人员也能重复该实验操作。首先用 PBS 轻柔地冲洗已分化的神经元培养板。将 PBS 沿培养板壁缓缓加入，避免直接冲向细胞，以防破坏细胞。

倾斜培养皿，从边缘吸去 PBS，注意不要触碰细胞。每 10 厘米培养皿加入至少 1 毫升蛋白酶溶液，并将细胞放回培养箱中孵育 40 至 45 分钟。

孵育期间，在相差显微镜下观察神经元，并持续进行蛋白酶消化处理，直至神经网络完全从培养板上脱离并开始解体。当神经元完全脱离后，按每1毫升蛋白酶加入5毫升新鲜DMEM培养基的方式终止消化。使用移液管轻轻将细胞反复吹打5至8次，吹打时注意不要施加过大压力。

将细胞逐滴通过100微米孔径的滤网过滤至50毫升锥形管中。用额外的5毫升新鲜DMEM培养基冲洗滤网。使用台式离心机以1000 × g离心5分钟，沉淀细胞。

离心后，将锥形管放回生物安全柜中，吸除大部分培养基，保留 250 微升以保持细胞湿润。用 2 毫升新鲜 DMEM 培养基轻轻重悬细胞，然后通过 5 毫升血清移液管的管口吹打混匀。最后，将管倒置 2 至 3 次。

使用血细胞计数板和台盼蓝对活细胞进行计数。然后用DMEM将细胞调整至所需浓度。根据特定细胞系的需求，向离心管中加入适量的补充物，并通过轻轻倾斜锥形管2至3次，轻柔混匀细胞。

从24孔板中吸出层粘连蛋白包被液，用PBS洗涤一次，吸去PBS。以“8”字形方式将细胞悬液加入各孔，避免细胞聚团。

接种细胞完成后，将培养板放回设定为37摄氏度和5%二氧化碳的培养箱中。短暂涡旋早期细胞死亡报告分子的储备液，并根据论文中的说明将其加入各孔中。等待20分钟。

然后在玻璃底多孔板中对活细胞和死细胞进行成像。延长蛋白酶孵育时间可使脱离的细胞层内的神经元网络变得松散，从而在解离时减少细胞死亡，并在随后几天内实现更高效的细胞回收。

采用延长的酶消化孵育步骤后，细胞在重新接种后的数天内活力大约提高一倍，且死亡或濒死细胞的密度较低。神经元分化过程中的过渡阶段持续数天，在此期间细胞逐渐表达晚期神经元标志物。在经过四周预分化后重新接种的培养物中，可立即检测到这些标志物。

延长的蛋白酶处理方案也能适度促进神经突的生长。总的神经突长度和树突生长均得到改善。重新接种对于研究突触也十分有用。

传代培养仅一周后，即可观察到突触前和突触后蛋白标志物。此外，通过钙成像或多电极阵列可检测到由自发性去极化和突触驱动电流产生的电活动。该传代培养方法可适用于多种类型的应用。

除了用于高内涵筛选以鉴定潜在的治疗化合物外，该方法还可用于生长锥成像或微电极阵列记录。对已经形成长突起的神经元进行机械解离具有较大的细胞应激。延长酶解孵育时间并轻柔地吹打细胞是本实验成功的关键步骤。