光介导的细胞分化及Xenopus胚胎发育过程中丝裂原活化蛋白激酶通路的可逆调控

本实验的总体目标是利用光在完整细胞和非洲爪蟾胚胎中控制丝裂原活化蛋白激酶信号通路。该方法有助于回答细胞生物学和发育生物学中的关键问题，例如激酶活性的时间调控如何影响细胞分化过程中的自我决定以及胚胎发育过程。该技术的主要优势在于，可在完整细胞及多细胞生物体（如正在发育的胚胎）中可逆地控制丝裂原活化蛋白激酶的活性。

该方法可用于研究非洲爪蟾胚胎发育过程中的信号传导动力学，也可应用于其他模式系统，如索科特拉蛙、斑马鱼或小鼠。今天，我实验室的一名研究生Vishnu Krishnamurthy将演示该实验流程。

此外，我实验室的博士后 Aurora Turgeon 将演示涉及非洲爪蟾胚胎的全部操作步骤。首先，将一个经高压灭菌的无菌 PDMS 腔室置于60 mm培养皿中经多聚赖氨酸（PLL）包被的无菌盖玻片上，以组装细胞培养装置。接着，使用0.5 mL 0.25%胰蛋白酶将pHK21细胞从6孔组织培养板的一个孔中消化下来。

使用血细胞计数板计数细胞密度后，将20,000个细胞接种至培养腔中，加入200微升细胞培养基。细胞铺板24小时后，按照生产商说明书，使用50至100纳克CRY2-mCherry-Raf1 2A2CIBMG of PCaA X质粒转染细胞。转染3小时后，更换为200微升新鲜培养基，并将细胞置于37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中孵育过夜，使其恢复。

第二天，首先将细胞培养基更换为 200 微升的二氧化碳无关培养基，然后开始光遗传学诱导和成像。设置数据采集程序：选择 488 纳米激发的 FITC 通道用于光遗传学刺激，选择 561 纳米激发的 CRITC 通道以追踪 mCherry 标记蛋白的细胞定位。

将功率计置于物镜窗口附近，测量蓝光的功率。总功率达到2微瓦即可诱导CIBN与CRY2-PHR结合。设置时间戳采集，时间间隔为5秒。

总采集时间为两分钟。在物镜窗口上涂抹适当的折射率匹配材料。将细胞培养腔室置于显微镜载物台上，使用明场模式并通过目镜聚焦到盖玻片表面的细胞。

接下来，移动显微镜载物台，在绿光下找到一个转染的细胞。在 FITC 和 CITC 通道中分别记录一系列带时间戳的图像。基础样本图像显示 CIBNGPCAAX 定位于细胞膜上。

这是在蓝光刺激前的 CRY2 mCherry raf1 快照，而此图像显示的是经过十次蓝光脉冲刺激后的 CRY2 mCherry raf1 快照。通过将蓝色 LED 插入两个面包板并连接限流电阻来制作 LED 阵列。将面包板放入铝盒中。

插入两根金属导线，将电路板连接到电源。当将光源箱放置在二氧化碳培养箱内时，确保导线长度足够。然后放置一个透明的光扩散板，作为光源箱的盖子。

最后，在一系列电压输入下校准每个LED的输出功率。在进行24小时PC12细胞分化实验时，使用0.2毫瓦/平方厘米的功率。将LED阵列置于37摄氏度、补充5%二氧化碳的培养箱中。

使用金属导线将其连接到电源，并将LED的功率设置为0.2毫瓦每平方厘米。将含有转染PC12细胞的12孔板放置在LED阵列的窗口上。调整板的位置，使每个孔均被完全照亮。

持续光照24小时。为成像已分化的细胞，设置单次快照数据采集，GFP和TexasRed通道均使用200毫秒曝光时间。

在GFP和TexasRed通道中拍摄转染细胞的图像，并将文件保存用于数据分析。首先，使用毛细管拉制仪拉制玻璃毛细管，制备用于RNA显微注射的针头。用含3%半胱氨酸的0.2 XMMR溶液处理胚胎15分钟，以去除其胶状包被。

将胚胎转移至3%多蔗糖和0.5倍MMR溶液中用于显微注射。准确向每个胚胎注射500皮克至1纳克的CRY2-mCherry-Raf1-2A-2CIBN-GFP-CaaX RNA。随后将注射后的胚胎在室温下置于显微注射溶液中培养。

当胚胎发育至中期原肠胚阶段时，将其转移至0.2x MMR溶液中，并继续培养至所需的发育阶段。随后将12孔板置于自制的LED阵列上进行蓝光处理。在12孔板上方放置一面镜子，以确保胚胎得到充分的蓝光照射。

在蓝光照射所需时间后，收集胚胎用于组织学、蛋白质印迹或基因表达分析。此图像显示了PC12细胞在0.2毫瓦/平方厘米的蓝光刺激24小时后，转染CRY2-2A-2CIBN的多通道快照。可见GFP和mCherry报告基因信号。

圆形标记已分化细胞，方形标记未分化细胞。此处细胞的处理方式与前一张图像中的细胞相同，但未使用蓝光刺激。未观察到分化现象。

这些细胞经转染组成型活性 raf1（raf1 GFPCaaX）后的结果具有代表性。圆形和矩形分别标记已分化和未分化的细胞。该直方图显示了转染了 CA-Raf1、共转染了 CRY2 mCherry raf1 与 CIBN GFP Caax，以及单独转染 CRY2A 2CIBN 的 PC12 细胞的分化比例。

只有暴露于蓝光的细胞显示出显著的分化。该图像显示了未注射mRNA且未进行光照处理的正常非洲爪蟾胚胎的形态。该图像显示了注射了CRY2-2A2CIBN mRNA并接受蓝光刺激的胚胎。

通过蓝光照射注射了CRY2 2A2CIBN的胚胎以激活raf1，可在头部区域诱导形成异位的尾状结构。采用此方法后，还可进一步回答其他问题，例如有丝分裂原活化蛋白激酶通路在特定发育阶段的激活如何调控基因表达。这种光遗传学方法可推广应用于调控具有类似激活机制的其他信号通路。