用于芯片开发与HIV抗体谱型分析的N-聚糖化学-酶法合成

本方法的总体目标是通过在氧化铝涂层玻璃载片上构建新型聚糖微阵列，建立一种模块化的化学-酶法合成N-聚糖的方法，用于检测HIV抗体对异源聚糖的结合。该方法有助于解答糖生物学中的关键问题，识别与细胞病毒特异性相关的聚糖，从而推动相关领域的深入发展。该方法的主要优势在于能够检测弱结合相互作用，并鉴定出与蛋白质（例如来自HIV患者的抗体）结合的糖类混合物。

该技术的应用可延伸至流感感染的诊断，因为唾液酸代谢物表达于人体呼吸道上皮细胞，且相关组织在症状出现时常受累。因此，糖芯片将成为确定野生型病毒亚型特异性的理想工具。尽管该方法可深入揭示HIV抗体对糖类的特异性，但它也可应用于其他系统，例如基于人血清抗体与固定于表面的人特异性血清抗原结合模式来诊断多种癌症。

开始此实验步骤时，将2-5微摩尔预先制备好的糖链加入5毫升圆底烧瓶中。向烧瓶中加入一个磁力搅拌子，并用橡胶隔垫密封。随后向烧瓶中加入400微升 freshly dried DMF（新鲜干燥的N,N-二甲基甲酰胺）和10-25微摩尔的膦酸连接剂。

然后，以800 rpm的转速搅拌反应混合物五小时。反应完成后，在5至10毫巴的真空压力及40摄氏度条件下，使用旋转蒸发仪蒸发溶剂。随后，将干燥的反应混合物溶于0.5毫升水中，并加样至聚丙烯酰胺凝胶层上方。

用水洗脱产物，并收集一到两毫升的馏分。通过薄层色谱（TLC）检测所收集的馏分：将每份馏分点样于TLC板上，然后将该板浸入0.25 mol的钼酸铵铈溶液中。用加热板加热染色后的TLC板以显色并观察产物。

合并含有产物的馏分后，将溶液冷冻干燥，得到白色粉末状的目标产物。接下来，将干燥产物溶于2毫升水中，并加入氢氧化钯。将一个充满氢气的气球连接到反应瓶上，在氢气氛围下以800 rpm的转速搅拌反应混合物15小时。

反应完成后，将混合物通过硅藻土层进行过滤，并用两毫升甲醇和两毫升去离子蒸馏水洗涤。然后，在300毫巴真空压力和40°C条件下，使用旋转蒸发仪蒸发溶剂。随后，将粗产物混合物溶于约一毫升水中，并加样至聚丙烯酰胺凝胶层顶部。

用水洗脱产物，并收集一到两毫升的馏分。合并含有产物的馏分，冷冻溶液后进行冷冻干燥，得到白色粉末状的目标产物。产物干燥后，使用重水作为溶剂，通过核磁共振和质谱法对其进行表征。

进行表面阳极氧化时，将温度可控的培养箱设定为4摄氏度。然后将预先配制的0.3摩尔水溶液草酸转移至含有磁力搅拌子的500毫升烧杯中。将一根10厘米长的铂棒作为阴极插入溶液中。

在整个阳极氧化过程中，以 300 rpm 的速度持续搅拌草酸。在实验室示踪软件中，单击设置按钮，然后单击功能选择“扫描电压”。将起始电压和终止电压均设为 25.8 伏特。

将点数设为100，合规性设为1，扫描延迟设为1200毫秒，然后点击确定。夹持一片铝涂层面向阴极的玻璃载片。

点击运行测试按钮，观察当前测量结果。表面阳极氧化后，用双蒸水彻底清洗载玻片，并用氮气吹干。将载玻片存放在相对湿度为30%的环境中，待后续使用。

制备时，将所有单价糖链在乙二醇中配制成10毫摩尔浓度的100微升溶液。用打印缓冲液稀释糖链溶液，得到100微摩尔的溶液。对于异源配体研究，向每种糖链溶液中加入5微升MAN-5糖链溶液。

将制备好的糖链转移至384孔微孔板中，用于微阵列点样步骤。将微孔板插入Array Tech打印机后，通过机器人针头将每种糖链溶液各0.6纳升点样到铝涂层玻片上，完成微阵列的打印。随后，配制70微升含3%BSA的初级抗体PG-9和PTSB缓冲液。

然后在避光条件下，配制含有3% BSA的120微升二抗荧光标记抗体（驴抗人免疫球蛋白G）与PBST缓冲液。将PG9与二抗荧光标记抗体按1:1比例混合。随后将预混的抗体在4摄氏度孵育30分钟。

孵育结束后，将一片镀铝玻璃载玻片放入分为16个孔的载玻片孵育腔中。向糖芯片中加入100 µL预混抗体溶液。在4 °C孵育16小时后，用移液器从糖芯片上移除预混抗体，然后取下载玻片孵育腔。

用PBST缓冲液和去离子水清洗玻片，然后在2000 × g条件下离心干燥玻片。接着，打开微阵列图像分析软件。

将干燥的玻璃载玻片插入阵列扫描仪中，使点阵面朝下。单击设置菜单，将图像分辨率设置为每像素 5 µm。

将波长设置为635纳米，PMT 450，功率设置为100%。单击扫描按钮以开始对切片进行成像。最后单击文件图标，将扫描图像以TIF格式保存，用于图像分析。在本研究中，采用模块化的化学-酶法策略合成了多种N-糖链。

为了验证该策略的有效性，通过化学酶法合成了一个双天线等轴结构。二糖1经酶法半乳糖基化，随后三糖2进行岩藻糖基化，得到目标四糖3。构建单元二和三的完全硫酸化及还原端修饰，得到了目标分子四和五。

六糖七通过三糖六的第四模块的立体选择性三次O-糖基化得到。去保护并经与第五模块反应后得到十一糖九。全局去保护得到糖链10，其结构经核磁共振和质谱分析确证。

在还原端带有戊胺尾链的糖类通过膦酸连接臂进行修饰，并利用膦化物化学法固定在铝镀膜玻璃表面。使用同源和异源糖阵列筛选 HIV-1 广谱中和抗体 PG9 的糖类特异性，首次证明了其与 HIV-1 PG120 表面 V1/V2 环区相邻异源糖类的相互作用。一旦掌握该技术，若操作正确，从糖类固定化到β分析可在 24 小时内完成。

在进行此操作时，重要的是要记住为聚糖10使用新近阳极氧化的铝涂层玻片。执行该操作时应使用医疗技术人员的玻片。可通过测定体常数来量化目标碳水化合物与蛋白质之间的结合相互作用。

该技术问世后，为研究人员深入理解碳水化合物在肯尼亚传染病中的作用奠定了基础，并有助于开发针对疾病的新型疗法。切记，操作有毒试剂时可能存在极高风险，进行实验时必须始终采取预防措施，例如穿戴防护服、护目镜和口罩。