利用光化学方法在水凝胶上图案化生物活性蛋白质或多肽以用于生物应用

本方法的总体目标是构建可固定化的生物活性空间蛋白图案，用于研究细胞反应。该方法利用生物材料策略重现体内信号。此技术能够精确模拟某些标准培养方法无法实现的信号模式，例如生长因子的时序性作用、细胞间信号传递以及空间特异性的生化线索。

本方案相较于现有方法具有重要意义，因其提供了一种简便的方法来调节基质刚度和蛋白质图案化。该方法不仅可进一步推动组织工程与再生医学技术的发展，还可应用于其他系统的研究，例如组织发育和干细胞命运。首先，按照随附文本方案中的描述，在无菌条件下配制主要水凝胶组分聚乙二醇二丙烯酸酯、光引发剂二苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰膦酸锂以及细胞外基质蛋白纤连蛋白的储备溶液。

使用0.22微米注射器滤器对每种溶液进行过滤除菌，然后方可使用或储存各分装样品。接着用铝箔包裹PEG-DA溶液，以避光保存。光引发剂储备溶液也需用铝箔包裹以避光，并将配制好的溶液在4°C条件下保存，可存放数月之久。

若纤维连接蛋白储存液已冷冻，请将无菌分装液置于冰上数小时或在4°C过夜解冻。首先对每个凝胶模具各灭菌一个聚酯膜片。然后，将每个凝胶模具所需的两张载玻片和三个塑料垫片浸泡于70%乙醇中至少两小时。

此外，将每个凝胶模具的五个长尾夹在70%乙醇中浸泡10分钟。将玻璃载片、垫片和长尾夹放置于细胞培养超净台内的小型高压灭菌纸上，使其晾干数小时。接着，通过将0.5毫米厚的塑料垫片放置在玻璃载片边缘周围，制备水凝胶模具。

将第二块载玻片置于上方，然后用长尾夹将间隔片紧密固定在一起。最后，在使用前将模具放入超净台中，打开紫外灯照射30分钟进行表面灭菌。灭菌进行到一半时，翻转模具以确保两面均得到充分暴露。

按照随附文本方案中的表一制备凝胶前体溶液。然后，将 PEG-DA、纤连蛋白和光引发剂按体积混合，以制备水凝胶。剧烈吹打溶液以确保混合均匀，但应避免产生气泡。

小心地将凝胶前体溶液用移液器加至凝胶模具的两片玻璃片之间。然后，将模具置于紫外光下照射一到两分钟，以形成水凝胶。凝胶完成后，取下回形夹，并通过对两侧间隔物施加相反的压力，轻轻取下顶部的玻璃片。

然后，使用合适尺寸的活检打孔器切取水凝胶样品。从凝胶矩形中切取多个水凝胶，作为重复样本和对照样本。将光刻掩模浸泡在70%乙醇中10分钟以进行灭菌。

然后，将光刻掩膜置于细胞培养罩中自然晾干。接着，每平方厘米取一到两微升巯基化蛋白质溶液，用移液器将其滴加到每个裁剪好的水凝胶表面，以实现表面图案化。重要的是要将蛋白质溶液均匀地铺展在水凝胶表面，以确保蛋白质固定均匀。

将光刻掩模小心地放置在水凝胶表面。轻轻按压掩模，以去除掩模与水凝胶表面之间形成的任何气泡。接着，将水凝胶置于紫外光下，再进行第二轮紫外光照射，持续30至60秒。

用 PBS 清洗水凝胶，以去除任何未反应的物质，并将每个水凝胶放置于孔板中，使图案表面朝上。然后，在 4 摄氏度条件下用 PBS 过夜清洗凝胶。移除孔中的 PBS，随后向每孔加入 250 µL 基础 EGM2 培养基，并在 37 摄氏度孵育 5 至 10 分钟。

孵育期间，使用标准技术将胰蛋白酶消化接近汇合的HUVECs细胞单层，使其成为单细胞悬液。然后离心细胞悬液，并小心移除上清液。用不含额外生长因子的基础EGM2重悬细胞沉淀，并取部分细胞悬液加入血细胞计数板中。

计数细胞以确定浓度。接着，将含有水凝胶的培养板在300 × g条件下离心3分钟，以确保水凝胶位于孔底而不会漂浮。必须确保水凝胶不在孔内漂浮。

漂浮的水凝胶会限制细胞接种的成功率，并给水凝胶成像带来困难。将每平方厘米75,000个细胞缓慢地滴加到每个水凝胶表面的中心，以避免扰动凝胶。随后，将培养板放入37°C的细胞培养箱中。

连续数天内，定期取出培养皿，观察细胞对蛋白图案的迁移反应。每两到三天更换一次培养基，每次更换50%。在制备水凝胶时，可使用不同浓度的前体聚乙二醇二丙烯酸酯（PEG-diacrylate），以获得所需基底刚度。

如图所示，20% PEG-DA 溶液对应的刚度超过 100 千帕。还需同时考虑光引发剂浓度和紫外光照射时间，因为任一变量的增加都会降低所连接分子的生物活性，此处以溶菌酶的生物活性为例表示。在水凝胶形成过程中尽量减少紫外光照射，对于保留后续蛋白质固定化反应所需的游离丙烯酸酯官能团至关重要。

暴露于紫外光超过两分钟的水凝胶无法形成图中红色所示的固定化蛋白质图案。此外，随着蛋白质图案接受紫外照射时间的延长，更多蛋白质会与表面发生反应。若制备得当，可在这些图案化的水凝胶基底上培养细胞，以调控其行为。

在此，将内皮细胞均匀接种于VEGF图案化PEG水凝胶表面。接种两天后，观察到内皮细胞向水凝胶中固定化VEGF的空间区域迁移。通过本实验方案的建立，研究人员可将其用于固定任何蛋白质或肽段，以探索适用于体外细胞系统的新型生物活性平台。

在进行该实验操作时，重要的是需注意尽量降低光引发剂的浓度以及紫外光照射时间，以保持固定化分子的生物活性。观看本视频后，您应能够充分掌握如何将具有生物活性的蛋白质和多肽图案化至聚乙二醇（PEG）水凝胶表面，如何将细胞均匀地接种到水凝胶上，并观察随后的细胞反应。