表面锚定的大分子DNA与荧光蛋白DNA结合肽的可视化

本实验的总体目标是建立一个适用于落射荧光显微镜的便捷DNA分析系统，用于在修饰玻璃表面操控单分子DNA。该方法有助于回答DNA可视化领域中的关键问题，特别是在研究DNA自身以及DNA结合蛋白和其他小分子时。

该技术的主要优势在于能够轻松地观察和分析运动中的 DNA。首先，将玻璃盖玻片放置在聚四氟乙烯（PTFE）支架上，并使用一段 PTFE 生料带将其固定。包裹盖玻片后，留出一段长约五厘米的生料带，以便在清洗过程中用于操作支架。

在通风橱中，将 350 毫升硫酸与 150 毫升过氧化氢加入一个 1 升的玻璃烧杯中，配制 piranha 蚀刻液。然后，将载玻片架放入该溶液中。两小时后，倒空烧杯，并用去离子水彻底冲洗载玻片。

继续冲洗盖玻片，直至烧杯中水的pH值达到中性。然后，将装有盖玻片的架子放入盛有水的烧杯中，超声处理30分钟，以清洁并活化玻璃基底。在进行氨基硅烷化前，将烧杯中的水倒净。首先，在一个洁净的聚丙烯容器中，将2毫升烷氧基硅烷和10毫升冰醋酸加入200毫升甲醇中，配制氨基硅烷化溶液。

随后将洁净的盖玻片放入溶液中。然后，将清洗后的盖玻片置于已配制好的溶液中，在室温下以100 rpm振荡30分钟。接着，将含有衍生化盖玻片的容器在75瓦功率下超声处理15分钟。

然后，在室温下以100 rpm的速度再次振荡至少30分钟。完成后，将烧杯中的溶液倒出，并小心地用甲醇冲洗盖玻片一次，再用乙醇冲洗两次，每次冲洗均需彻底。

最后一次漂洗后，将盖玻片保存在乙醇中，并在两周内使用。首先，配制10毫升0.1摩尔的碳酸氢钠溶液，并通过0.22微米针头滤器过滤。然后，将2毫克生物素聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯和80毫克聚乙二醇琥珀酰亚胺戊酸酯溶解于350微升过滤后的碳酸氢钠溶液中。

使用避光管保护溶液免受光照。剧烈涡旋振荡管子10秒，然后在10,000 × g离心1分钟以去除任何气泡。接下来，用丙酮冲洗载玻片，再用乙醇冲洗。

冲洗后，让载玻片完全自然晾干。在洁净的玻璃载玻片上滴加50 µL的PEG溶液。将氨基硅烷化盖玻片以轻微倾斜的角度缓慢地盖在液滴上，避免在盖玻片下产生气泡。

然后，将载玻片放入一个水平、避光且湿润的孵育 chamber 中，在室温下孵育至少三小时至过夜。孵育结束后，将剩余的 PEG 溶液密封于避光管中，并于 4 摄氏度保存。孵育完成后，用去离子水彻底冲洗 PEG 修饰的盖玻片，随后将其置于避光干燥处保存，直至使用。

为了构建流动室，将双面胶带条贴在丙烯酸支架上，使其与进样口和出样口垂直对齐，并且不干扰任何通道孔。然后，使用移液器吸头按压胶带，以密封通道。接着，将一片经聚乙二醇（PEG）修饰的盖玻片、使修饰面朝下，放置在胶带顶部，以形成流动室。

为防止溶液泄漏，将盖玻片的顶部按压在双面胶带所在区域上。然后，在腔室边缘涂上快干环氧胶以固定盖玻片。接下来，将一段2.5厘米长的管路连接到气密注射器上，并用环氧胶密封连接处。

然后，将一根长而柔软的管子连接到从注射器引出的管路上，并再次使用环氧树脂胶密封接头。用去离子水充满与注射器相连的管路，确保其中无气泡。

接下来，将管路插入用环氧树脂胶密封的流动室孔中，并在另一个孔上安装一个200微升的移液器吸头，用作储液池。将注射泵的流速设置为50微升每分钟。

然后，将20微升的亲和素蛋白溶液注入腔室，并孵育10分钟。接着，将20微升生物素化的寡核苷酸溶液装入注射器，注入腔室，并孵育10分钟。

若使用末端转移酶，则跳过寡核苷酸的加载步骤。然后，将 20 微升 DNA 溶液装入注射器中，以每分钟 10 微升的流速注入反应室，并保持 30 分钟。孵育 30 分钟后，用 40 微升 1× TE 缓冲液以每分钟 50 微升的流速洗涤流动室。

洗涤后，在1X TE缓冲液中加入40微升浓度为80纳摩尔的FP-DBP。为观察DNA分子的完整伸展范围，应根据所用DNA的长度施加不同的流速。使用荧光显微镜配合60倍物镜观察DNA。以下是一段荧光显微镜视频，显示了 bacteriophage lambda DNA分子通过与生物素标记的互补寡核苷酸连接后，被流体拉伸并固定在表面的过程。

在流动条件下，完全伸展的 DNA 分子长度为 16.5 微米。相比之下，噬菌体 T4 DNA 分子在流动条件下可伸长至 56.4 微米。这种伸展是可逆的，DNA 可以多次被拉伸和松弛。

观看本视频后，您应能充分理解如何在更大的 DNA 分析中使用 FP-DBP，并能够演示 DNA 聚合物的拉伸与松弛过程。