利用前体同位素标记与等重标签联用技术（cPILOT）实现自动化样本多重分析

我们的自动化cPILOT方案使研究人员能够以高通量方式更便捷地分析样品。这一方法具有重要意义，因为它使我们能够更快地获取有关疾病或不同生理状态的生物学信息。该技术的主要优势在于能够并行处理多个样品，从而在使用高通量样品的同时减少可操作性错误。

我们的实验室致力于与衰老和阿尔茨海默病相关的应用研究。然而，该技术也可用于研究任何涉及生物组织的疾病或挑战。首先开启正压装置、加热与冷却设备以及真空泵。

将所有配件连接到液体处理仪，当其与计算机连接并准备就绪时，指示灯将显示蓝色。取300 µL肝匀浆液，分装至500 µL离心管中，并置于2 mL深孔板上。在实验方案开始前，将样品保存于4 °C环境中。

在软件中打开方法，将所需的吸头和实验耗材放置到指定位置。然后与最终的仪器布局图进行核对，点击“下一步”以继续执行实验方案。装载 230 微升吸头，从储液槽中吸取 90 微升 8 摩尔尿素溶液。

然后将其加入黑色2毫升深孔板的第一行。卸下TL1的吸头，并重复此步骤，直至所有孔中均加入尿素。加入变性缓冲液后，使用90微升吸头将10微升小鼠肝脏匀浆转移至深孔板中。

卸下移液枪头，然后装载一排90微升枪头，从试剂板1中吸取3微升DTT。将DTT分配至深孔板的第1和第2行。用铝箔密封样品板，并在37摄氏度下孵育600秒，同时以300 RPM转速旋转。

孵育结束后，装载一排90微升吸头，从第一试剂板第三行吸取6微升IAM，加入样品板第一行。密封样品板，在冷却装置上以4°C、300 RPM转速旋转孵育30分钟。然后打开样品板密封，装载一排90微升吸头。

从第一块试剂板第二行吸取5 µL胱氨酸，加入样本板的第一行和第二行。在室温下孵育30分钟。孵育结束后，以1800 RPM的转速振荡30分钟。

然后向样品板的每个孔中加入 800 微升含有 10 毫摩尔氯化钙的 20 毫摩尔 Tris 缓冲液，使尿素浓度稀释至 2 摩尔。向 96 孔板的第一行加入 20 微升胰蛋白酶，并将该板放置在甲板上的指定位置。在向样品板中加入胰蛋白酶后，密封该板，并在加热冷却装置中于 37 摄氏度、600 转/分钟条件下孵育 15 小时。

通过从甲酸板的第三行吸取150微升5%甲酸并将其加入样本板的第一行和第二行，终止消化反应。随后进行肽段脱盐。使用1070微升吸头吸取600微升乙腈。

然后将液体加入固相萃取（SPE）板的第一和第二排，以活化C-18柱。接着，将消化后的样品分两次上样至SPE板。安装两排吸头，吸取534 µL消化后的样品，转移至SPE板的第一和第二排。

对板施加压力，并重复此步骤直至所有样品均完成上样。用水平衡肽段，然后用含0.1%甲酸的60%至40%乙腈溶液稀释肽段。随后将板置于收集板上方，使用正压装置洗脱肽段。

吸取流穿液，于软件中设置所需的吸头和实验耗材，并与仪器平台布局核对无误后，点击“下一步”以继续进行二甲基化实验流程。用1%乙酸溶解肽段。为进行二甲基化标记，装载90微升吸头，从第二块试剂板的第二行中吸取16微升60毫摩尔的轻型甲醛。

将其加入样品板的第一行，然后卸下吸头。装载一排90微升吸头，从第二试剂板的第三行吸取16微升60毫摩尔的重甲醛。将其加入样品板的第二行，然后卸下吸头。

加载两排90微升吸头，从3号试剂板的第一排和第二排分别吸取16微升24毫摩尔的氰基硼氢化钠和24毫摩尔的氰基硼氘化钠，然后将试剂分别加入样品板的第一排和第二排，以启动二甲基化反应。卸下吸头后，使用轨道摇床在1800转/分钟的条件下定时振荡15分钟。然后加载两排90微升吸头，从3号试剂板的第三排和第四排吸取32微升1%氨水。

将样本加入第二个样品板的第一和第二行以终止反应。在新的2毫升深孔板中，将等体积的轻链和重链二甲基化肽段混合，用于脱盐。脱盐完成后，将合并的轻链和重链肽段进行真空干燥，并进行同重标记。

将肽段与100微升100毫摩尔三乙基碳酸氢铵缓冲液在旋转摇床上重悬。然后使用90微升枪头吸取25微升混合的二甲基化肽段，转移至TMT处理板的第一排。装载一排90微升枪头，吸取10微升TMT试剂。

将溶液加入TMT处理板的第一行，卸下吸头，然后在1800 RPM条件下定时振荡一小时。从TEAB板的第二行吸取8微升羟胺，并将其加入TMT处理板的第一行。在1800 RPM振荡15分钟后，将30.5微升TMT标记的肽段转移至1.5毫升离心管中。

然后根据论文中的说明进行数据采集和分析。此处展示的是在22重plex联合前体同位素标记与等重标记实验中，从全部22个报告离子通道鉴定出的一个肽段的代表性质谱数据。该肽段的序列对应于甜菜碱-同型半胱氨酸S-甲基转移酶。

对轻链和重链二甲基化峰中强度最高的碎片离子进一步进行MS3碎裂分析。报告离子的强度与样品中肽段的丰度成正比。总体而言，这种结合前体同位素标记与等重标记的实验方法缩短了样品处理时间，并实现了在多个通道或条件下对蛋白质表达水平的可视化分析。

所有22个通道中，以总报告离子强度为基准的log10丰度箱线图显示，孔间或样本间的变异性较低。通过分析22个样本中每种蛋白质的报告离子丰度误差，对整体自动化程度进行了评估。使用机器人平台进行样本处理，所得变异系数极低。

在3098种肽段中，轻链和重链二甲基化肽段的报告离子丰度变异系数平均值分别为12.36%和15.03%。在实施本方案时，需注意同位素和同重素标记在同一实验中同时使用，因此必须仔细规划，为每个样本分配实验中拟使用的标签。

该方法可轻松整合到其他机器人系统中，并可应用于多种组织样本，例如组织或细胞裂解液以及其他生物液体。