提高高分子量生物素化葡聚糖胺在大鼠丘脑皮层投射示踪中的应用

本视频的总体目标是展示一种优化的高分子量BDA应用方案，用于研究中枢神经系统中的最佳神经标记。该方法有助于回答神经网络领域中的关键问题，通过神经回路可视化神经标记的框架结构。

该技术的主要优势在于能够启动局部神经环路并研究其化学特性。准备一支一微升微量注射器，配备玻璃微量移液管，并通过吸取液体石蜡进行测试。按照批准的方案麻醉大鼠后，通过夹捏尾巴无反应来确认深度麻醉状态。

然后使用电动剃刀剃除动物头部上方的毛发，并用10%聚维酮碘擦洗手术部位，随后使用70%乙醇进行消毒。将大鼠固定于立体定位仪上，方法是将钝性耳棒插入耳道，并将大鼠的上门齿钩入齿槽固定器中。在眼睛上涂抹眼用软膏。

使用无菌外科手套和手术单以维持无菌环境。用70%乙醇再次清洁手术部位的头部皮肤。用手术刀沿矢状缝做矢状切口后，使用无菌棉签刮除颅骨上的肌肉和骨膜。

根据图谱中的预定义坐标，确定颅骨开窗的位置。使用带有圆头钻头的磨钻进行颅骨开窗，钻至约一毫米深度，直至可见脑膜。使用显微镊切除硬脑膜，暴露注射部位上方的脑皮层。

将液体石蜡从微量注射器中排出，然后吸入10% BDA溶液。将注射器安装到显微注射装置上，并连接微泵。在体视显微镜下操作显微注射装置。

将装有溶液的玻璃微量移液管从脑皮层表面插入丘脑腹后内侧核（VPM），深度达5.8毫米。然后使用微型泵在3分钟内向VPM内压力注射100纳升10% BDA。5分钟后，缓慢撤出移液管。

用无菌缝合线缝合伤口，然后将大鼠置于温暖的恢复区域，直至其恢复意识并完全苏醒。处死大鼠后，使用剪刀和镊子打开大鼠的胸腔以暴露心脏。将静脉导管插入左心室，朝向主动脉方向，并剪开右心耳。

首先，用生理温度下的0.9%生理盐水灌注约一到两分钟，直至从心脏流出的血液变清。然后继续使用250至300毫升的4%多聚甲醛（溶于0.1摩尔磷酸盐缓冲液中）进行灌注。将取出的脑组织在4%多聚甲醛中室温下后固定两小时。

然后将脑组织转移至含有30%蔗糖的0.1摩尔磷酸盐缓冲液中，在4摄氏度下进行三天的冷冻保护。三天后，当脑组织沉入溶液底部时，借助脑切片模具，将脑组织沿冠状方向分为三个部分。中央部分包含丘脑腹后内侧核，位于初级躯体感觉皮层。

将脑组织的中央部分固定在滑动式切片机的冷冻台上，待其完全冻结后，进行冠状面切片，厚度为 40 微米。将切下的脑片收集至六孔板中，孔内预先加入 0.1 摩尔的 PBS 缓冲液。开始染色前，用 0.1 摩尔 PBS 缓冲液在摇床上轻轻冲洗脑片约 1 分钟。

然后将切片转移至含有0.3% Triton X-100的0.1摩尔PBS中，该溶液同时含有链霉亲和素-AF594和AF500/525绿色荧光尼氏染料，室温孵育两小时。染色后，在0.1摩尔PB中振荡洗涤切片三次。使用标准组织化学技术将切片封片于显微镜载玻片上。

将切片风干约一小时。在成像前，向荧光切片上滴加50%甘油溶于蒸馏水的溶液，并加盖盖玻片。该代表性显微照片显示了在绿色尼氏染色背景下，生物素葡聚糖胺（BDA）注射至丘脑腹后内侧核的位点，呈红色。

此处展示了透射荧光BDA标记结果，包括位于第四层的丘脑皮层轴突以及位于第五层和第六层的皮层丘脑神经元。作为对比，该显微照片显示，采用标准的亲和素-生物素过氧化物酶方法的传统BDA标记呈现出与透射荧光BDA标记相似的神经元标记模式。该透射荧光BDA标记切片的高倍放大图像详细展示了顺行标记的轴突树突结构，呈红色。

此处详细展示了逆向标记的神经元胞体、树突及树突棘。一旦掌握，如果操作得当，开颅和立体定位注射可在 20 至 30 分钟内完成。观看本视频后，您应能充分理解如何应用高分子量 BDA 来重建神经元连接，以及神经元标记的精细结构。