PAR-CliP——一种用于鉴定RNA结合蛋白转录组范围结合位点的方法

本实验的总体目标是确定RNA结合蛋白或RVP在转录组范围内的结合位点。首先使用光反应性核苷酸类似物对新生转录本进行体内标记来实现该目标。实验的第二步是利用365纳米紫外光将RNA与RNA结合蛋白进行交联。

该实验流程的第三步是免疫沉淀目标 RNA 结合蛋白，并回收与 RNA 发生交联的复合物。流程的最后一步是将 RNA 转化为 cDNA 文库并进行深度测序。最终可获得全转录组范围内的 RBP 结合位点图谱，从而能够确定 RNA 识别元件及其结合偏好性。

大家好，我是来自纽约洛克菲勒大学 Tom SEL 实验室的 Marcus Hoffner。今天我们将展示一种名为 PAR-CLIP（光活化核糖核苷类似物增强的交联与免疫沉淀）的方法。我们实验室使用该技术在转录组范围内鉴定 RNA 结合蛋白的结合位点及其结合基序与偏好性。

好的，我们开始吧。体内紫外交联实验在超净工作台中进行。本实验方案将以带有标签的IGF2BP1细胞作为示例模型，采用无菌技术操作。

在HEK 293细胞培养基中扩增稳定表达Tet抑制子调控的flag-HA标记IGF2BP1的HEK 293细胞，使用100至400 × 10⁶个细胞，并培养至约80%汇合度。在交联前14小时，将光反应性核糖核苷类似物4-硫代尿苷（4-SU）直接加入细胞培养基中。或者，也可使用6-硫代鸟苷（6-SG）。加入光反应性核糖核苷后，通过添加多西环素诱导flag-HA标记IGF2BP1的表达，随后将细胞在细胞培养箱中孵育过夜。

接下来，倾去培养基。然后每块培养板用 10 毫升冰预冷的磷酸盐缓冲液洗涤一次。再通过倾倒完全去除 PBS。

将未加盖的培养皿置于装有冰的托盘上，使用Stratalinker 2400紫外交联仪或同等设备，以365纳米紫外光照射。照射后，每块培养皿中加入1毫升PBS，用橡胶刮棒刮下细胞。将细胞转移至50毫升离心管中，在4摄氏度下以500 × g离心5分钟。弃去上清液，保留细胞沉淀。

此时，细胞沉淀可用液氮速冻，并在零下 80 ℃ 保存至少 12 个月。如需继续操作，将沉淀重悬于三倍体积的 1× NP-40 裂解缓冲液中，冰上孵育 10 分钟。在 4 ℃ 条件下，以 13,000 ×g 离心 15 分钟，澄清细胞裂解液。

离心后，通过五微米膜注射器滤器进一步过滤裂解液以澄清。最后，加入RNAs T至终浓度为每微升一个单位，并在22摄氏度水浴中孵育15分钟。随后，将反应体系置于冰上冷却5分钟。

在体内紫外交联后，准备用于免疫沉淀的磁珠。每1毫升细胞裂解液，取10微升Dynabeads Protein G磁珠颗粒，转移至1.5毫升微量离心管中。

然后将含有磁珠的离心管置于磁力架上静置一到两分钟。移除上清液，并在磁力分离器上的离心管中加入一毫升柠檬酸磷酸盐缓冲液。接着盖紧管盖，涡旋震荡样品以重新悬浮磁珠。

短暂离心，以收集管盖中残留的任何珠粒。用额外的一毫升柠檬酸盐磷酸盐缓冲液重复此洗涤步骤。洗涤完成后，将珠粒和柠檬酸盐磷酸盐缓冲液重悬，总体积为原始珠粒悬液体积的两倍。

然后，每1毫升磁珠悬液中加入0.25毫克抗Flag M2单克隆抗体。将悬液在室温下于旋转仪上孵育40分钟。孵育结束后，按前述方法用1毫升柠檬酸磷酸盐缓冲液洗涤磁珠两次，此步骤旨在去除未结合的抗体。洗涤后，将磁珠重新悬浮于柠檬酸磷酸盐缓冲液中，如同前述步骤四。开始免疫沉淀时，将 freshly prepared 抗体偶联磁珠加入经RNAs T1处理的细胞裂解液中。

将混合物转移至15毫升离心管中，在4摄氏度下旋转孵育一小时。孵育结束后，收集磁珠，弃去上清液，将磁珠重悬于1毫升IP洗涤缓冲液中，并转移至1.5毫升离心管中。用1毫升IP洗涤缓冲液按前述方法洗涤磁珠两次。

最后一次洗涤后，将磁珠重悬于与原始磁珠体积相同的免疫沉淀洗涤缓冲液中。然后加入RNAT，使其终浓度为每微升100单位。将磁珠悬液置于22摄氏度水浴中孵育15分钟。

随后将悬浮液置于冰上冷却五分钟。接着用一毫升高盐洗涤缓冲液洗涤磁珠三次。然后将磁珠重悬于一体积原始磁珠量的去磷酸化缓冲液中。

加入小牛肠碱性磷酸酶，使其终浓度为每微升0.5单位，在37摄氏度下孵育悬浮液10分钟。用1毫升磷酸酶洗涤缓冲液洗涤磁珠两次，再用不含DTT的多核苷酸激酶（PNK）缓冲液洗涤两次。最后将磁珠重悬于相当于原始磁珠体积的PNK缓冲液中。

开始对交联的 RNA 进行放射性标记。向新制备的珠子悬液的一份原始珠子体积中加入 γ-32P-ATP 和 T4 多核苷酸激酶（T4 PNK）。在 37 摄氏度下孵育该悬液 30 分钟。

接下来，向悬浮液中加入非放射性a TP，在37摄氏度下再孵育五分钟。然后用不含DTT的PNK缓冲液将磁珠洗涤五次，每次800微升。最后，将磁珠重悬于70微升SDS page中。

将上样缓冲液与放射性标记的悬液在95摄氏度的加热块中孵育5分钟，以变性并释放免疫沉淀的RNA结合蛋白及其交联的RNA。随后，将磁珠从分离器上移除，并将上清液转移至洁净的1.5毫升微量离心管中。每孔上样40微升样品至Novex Bis-Tris 4–12%预制聚丙烯酰胺凝胶的每个孔中，在200伏电压下电泳55分钟。电泳结束后，拆卸电泳槽并分离玻璃板，保留凝胶附着于其中一块玻璃板上，以便将凝胶与磷屏成像纸的打印结果进行对齐。

在凝胶的三个角落非对称地植入三小块放射性凝胶。用塑料膜（如保鲜膜）包裹凝胶，以防止污染。将凝胶暴露于空白的磷屏成像仪屏幕中一小时，然后在磷屏成像仪上进行成像。

接下来，利用植入的凝胶碎片作为定位参照，将凝胶对齐放置在磷屏成像打印图上。切下与预期大小相符的RNA结合蛋白（RBP）条带。将条带转移至dtu透析器MIDI管中，并加入800微升1× SDS电泳缓冲液进行电洗脱。

按照制造商说明，将交联的RNA-RBP复合物在100伏电压下电泳两小时。电洗脱后，加入蛋白酶K缓冲液和蛋白酶K，在55摄氏度下孵育溶液30分钟。

通过酸性酚-氯仿-异戊醇抽提回收RNA，随后进行一次氯仿抽提。然后加入一微升糖原，并加入三倍体积的乙醇沉淀RNA。最后将所得沉淀溶解于10.5微升水中。

在RNA回收后，按照标准的cDNA文库构建流程进行操作，并对测序读段进行严谨的生物信息学分析。以表达Flag-HA标签IGF2BP1的HK293细胞进行PAR-CLIP实验的代表性结果为例，实验中使用了光反应性核苷类似物4-SU和6-SG。替代性光反应性核糖核苷6-SG的交联效率通常低于4-SU。较低的交联效率可能导致来自高丰度细胞RNA片段的背景序列增加，因此实验初始应使用更多的细胞。

不同的PAR-CLIP光反应性尿苷类似物与传统的254纳米紫外交联或CLIP进行了比较，如图所示。254纳米紫外RNA-蛋白交联的交联效率有限。适当大小的放射性条带强度可指示PAR-CLIP实验是否成功，以及是否已分离到足够量的RNA以进行小RNA测序流程。

在进行生物信息学分析后，测序读段中特征性突变的频率可指示成功交联的序列。使用4-SU时，这些突变为胸腺嘧啶（T）到胞嘧啶（C）的转换；使用6-SG时，则为鸟嘌呤（G）到腺嘌呤（A）的转换。PAR-CLIP 的显著特征在于，可通过分析从回收 RNA 构建的 cDNA 文库中所含的特征性突变，来确定交联位点的位置。

这使得能够轻松区分来自特异性结合RNA的信号与来自共分离的高丰度细胞RNA片段序列的背景噪音。因此，今天我们向您展示了如何分离出RNA结合蛋白特异性识别的RNA片段。进行此操作时。

必须确保RNA处于无污染的状态。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。