探索序列空间以鉴定调控性RNA结合蛋白的结合位点

该方案用于蛋白质结合位点的饱和突变。如果您的蛋白质结合位点未知，可使用此方案进行鉴定。该技术在疾病诊断与治疗中具有重要意义。

我认为该方法在生物医学科学中的全部潜力仍有待充分发掘。该方法可广泛应用于任何蛋白质或反应体系，只要能够将目标分子与非目标分子分离开即可。确保文库经过充分随机化，并确保在每一次结合与分离步骤中，目标分子的富集倍数均保持较高水平。

该过程包含多个步骤和诸多细节，通过演示比单纯文字描述更为直观。观看本视频后，您将能够熟练掌握如何制备随机文库、合成起始RNA文库，以及如何进行结合反应以分离目标分子与非目标分子，从而获得高亲和力和特异性的结合分子。首先，使用DNA合成仪通过化学合成方法合成正向引物和反向引物。

同时，合成一个包含31个随机化位点的随机文库寡核苷酸模板。在PCR管中，加入1微摩尔的DNA随机文库模板、1微摩尔含有T7 RNA聚合酶启动子的正向引物和反向引物、pH为8的20毫摩尔Tris缓冲液、1.5毫摩尔氯化镁、50毫摩尔氯化钾、1微克/毫升乙酰化牛血清白蛋白、2单位Taq DNA聚合酶，以及每种200微摩尔的dNTPs。将PCR仪程序设置为进行5个循环的变性、退火和延伸步骤，随后进行1个循环的延伸反应，以将启动子连接至DNA文库。

设置一个100微升的转录反应体系，其中包含T7转录缓冲液、1微摩尔的随机文库DNA、5毫摩尔的DTT、2毫摩尔的GTP、每种1毫摩尔的ATP、CTP和UTP，以及每微升2单位的T7 RNA聚合酶。现在戴上丙烯酸玻璃防护罩和手套。通过向转录反应体系中加入5微升或更少的α-32P UTP，引入放射性以用于放射自显影。

将反应混合物置于微量离心管中，在 37 摄氏度下孵育两小时。为进行RNA凝胶纯化，配制10%变性聚丙烯酰胺凝胶。将样品加入凝胶的加样孔中。

将凝胶暴露于X射线胶片，确定凝胶上转录本的位置，并切下相应的凝胶条带。将凝胶条带放入离心管中，用匀浆器尖端将其破碎成较小的碎片。加入蛋白酶K缓冲液，使凝胶碎片完全浸没。

将离心管置于旋转混合仪上，室温孵育至少两小时。然后在室温下以高速微量离心机离心五分钟，以去除凝胶碎片并回收缓冲液。向含有上清液的离心管中加入等体积的苯酚-氯仿溶液，涡旋混匀，随后离心。

再用酚-氯仿提取一次，然后用氯仿再提取一次。接着，向蛋白酶K缓冲液的水相中加入1/10体积的pH 5.2的3摩尔醋酸钠、10微克tRNA或20微克糖原，以及两到三倍体积的-20摄氏度保存的乙醇。将离心管置于-80摄氏度下静置1小时。

将含有溶液的离心管在4 °C下以微量离心机离心5至10分钟。小心弃去上清液，并加入70%乙醇洗涤RNA沉淀。再离心2至5分钟。

小心吸除乙醇，并将RNA沉淀在空气中干燥。接着，加入50 µL经DEPC处理的水以溶解RNA沉淀。将样品置于-20 °C保存。

在100微升反应体系中结合蛋白质和RNA时，首先配制含有50毫摩尔氯化钾、1毫摩尔DTT、0.9微克/微升牛血清白蛋白、5单位/微升RNAsin、15微克/微升tRNA以及1毫摩尔EDTA的10毫摩尔Tris盐酸缓冲液（pH 7.5）。然后加入30微升重组蛋白PTB和10微升来自相应文库的RNA。将含有结合反应液的离心管置于25摄氏度的温控仪中孵育约30分钟。

接下来，通过四轮筛选和扩增，将结合的 RNA 与未结合的 RNA 进行分离。首先，在室温下将 100 微升样品通过连接至真空过滤装置的硝酸纤维素滤膜进行过滤。RNA-蛋白质复合物将留在滤膜上。

使用无菌剃须刀片将滤膜切成碎片，并将这些碎片插入离心管中。将滤膜碎片浸入蛋白酶K缓冲液中，置于旋转摇床中至少三小时或过夜，以回收RNA。为去除RNA样本中的蛋白质，加入等体积的苯酚-氯仿溶液，涡旋振荡，然后在室温下高速离心五分钟。

取水相，再次用氯仿进行萃取。随后，向该上清液中加入1/10体积pH 5.2的3摩尔乙酸钠溶液以及2至3体积的无水乙醇，混匀。将离心管置于-80摄氏度冰箱中静置30分钟，然后高速离心10分钟。

用70%乙醇重复洗涤和干燥步骤，并将RNA溶于经DEPC处理的水中。在完成第一轮滤膜结合实验后，再进行三轮实验。接下来，进行两轮转录、结合和扩增，以分离与蛋白质结合的RNA组分和未结合的RNA组分。

使用5x TBE缓冲液配制天然5%聚丙烯酰胺凝胶，丙烯酰胺与双丙烯酰胺的比例为60:1。然后建立RNA-蛋白质结合反应。将凝胶置于装有5x TBE缓冲液的电泳装置中，并在4摄氏度的冷室中进行电泳。

施加250伏电压持续15分钟，并将结合反应液转移至不同的孔中。然后以250伏电压进行电泳，持续1至2小时，进一步分离结合的RNA与未结合的RNA。接着将凝胶暴露于X射线胶片，通过放射自显影确定结合RNA的位置。

用刀切下含有结合RNA的凝胶片段，并将其放入离心管中。将凝胶片段碾碎，加入蛋白酶K缓冲液，37℃孵育3小时或过夜。随后按照前述方法，用酚-氯仿和氯仿重复抽提一次。

从溶解的RNA中合成cDNA。准备20微升反应体系，包含2微升10x RT缓冲液、2微升AMV逆转录酶、1微升逆转录引物、5微升水和10微升溶解的RNA。在42摄氏度孵育60分钟。

使用先前所述的方法，通过20至25个PCR循环扩增cDNA。重复进行RNA合成、蛋白质结合以及结合与未结合组分的分离过程。为分析蛋白质结合情况，采用凝胶迁移率变动实验或滤膜结合实验，以确定所选文库或各文库中特定序列的结合亲和力和特异性。

使用放射自显影或磷屏成像仪检测并定量结合组分和未结合组分中的条带。继续进行克隆和序列比对实验步骤。本研究中，成功实现了筛选-扩增。

哺乳动物多嘧啶区结合蛋白在蛋白质浓度高出300倍的情况下，对零号序列的结合几乎无法检测，但对所选序列库表现出高亲和力。通过筛选-扩增方法成功鉴定了具有偏好性或共识结合位点的RNA结合蛋白。添加能够结合上游3'剪接位点的重组PTB蛋白，可导致替代性或下游3'剪接位点的激活。

相比之下，加入重组hnRNP C会导致两个3'剪接位点均被抑制。加入重组的通用剪接因子U2AF65可逆转hnRNP C介导的3'剪接位点抑制作用。需要牢记的是，一个良好的随机化文库以及适当的结合条件（在每步结合中均能实现高倍数富集）是实验成功的关键。

可采用适当的体外功能检测和体内实验来验证该方法的结果。在基因表达研究领域，已有大量蛋白质的功能通过该技术得到研究。在操作聚丙烯酰胺和放射性物质时，必须佩戴手套并使用放射性密封材料进行防护。