用于补体受体1长度多态性基因分型的高分辨率熔解PCR：阿尔茨海默病基因易感性评估的创新工具

本方法的总体目标是对补体受体1（CR1）的长度多态性进行基因分型，以用于评估个体对阿尔茨海默病等疾病的易感性，从而更深入地理解CR1亚型在疾病发病机制中的作用。该方法有助于回答神经科学领域中的关键问题，例如阿尔茨海默病的发病机制。该技术的主要优势在于无需新鲜血液样本，且操作更简便、成本更低、速度更快，因此适用于更大规模的人群研究。

当我们意识到进行Western印迹实验在所需时间以及需要新鲜血液样本方面存在挑战时，便首次提出了该方法。将20微升蛋白酶K用移液器加入一个1.5毫升离心管底部。然后，向管中加入200微升样本。

向样品中加入 200 微升裂解缓冲液。脉冲涡旋振荡 15 秒以混匀。混匀后，在水浴中 56 摄氏度孵育 10 分钟。

短暂离心1.5毫升离心管，以去除管盖内壁的液滴。然后向样品中加入100 µL乙醇。再次短暂涡旋振荡15秒混匀，之后像之前一样短暂离心离心管。

接下来，将混合物小心地加入装有2毫升收集管的膜柱中。在不润湿管口边缘的情况下，盖上盖子，并在6,000 × g条件下离心1分钟。将膜柱转移至一个新的洁净2毫升收集管中，弃去含有滤液的收集管。

小心打开膜柱，加入500 µL洗涤缓冲液一，注意不要润湿边缘。盖紧管盖，于6,000 ×g离心1分钟。随后，将膜柱转移至一个新的2 mL收集管中，并弃去含有滤液的收集管。

小心打开膜柱后，加入500 µL洗涤缓冲液2，注意不要润湿管口边缘。盖紧管盖，在20,000 ×g条件下离心3分钟。然后将膜柱转移至一个新的2 mL收集管中，再次离心。

离心后，将膜柱放入干净的1.5毫升离心管中，并弃去含有滤液的收集管。小心打开膜柱，加入200 µL蒸馏水。室温孵育5分钟后，在6,000 ×g条件下离心1分钟。

进行HRM-PCR实验时，首先将DNA样本加入1.5毫升离心管中，用水稀释至浓度为10纳克/微升。接着，将解冻的引物溶液用1.5毫升离心管加水稀释至6微摩尔/升的相同浓度。解冻HRM-PCR试剂盒中的各溶液，并轻轻涡旋混匀，以确保充分回收所有组分。

将含有酶混合物、DNA结合染料、氯化镁和水的三个小管在微量离心机中短暂离心后再打开。在室温下，于1.5毫升离心管中，按照文本方案所述，使用上述组分配制用于120 µL反应的PCR混合液。通过涡旋轻轻混匀。

必须严格按照分子生物学的良好操作规范，认真细致地进行实验操作。将19微升PCR混合液加入白色多孔板的每个孔中。随后加入1微升浓度已调整好的DNA模板，然后用密封膜将白色多孔板密封。

将白色多孔板放入配备适用于多孔板转子及相应适配器的标准摆桶式离心机中，以1,500 ×g离心1分钟。将白色多孔板装载至高分辨率熔解曲线PCR（HRM-PCR）仪器中。根据文本方案中提供的PCR条件，启动HRM-PCR程序。

在完成HRM-PCR反应后，按照文本方案中所述进行HRM分析，以确定CR1长度多态性。通过软件分析基因组DNA中不同CR1同种型受试者PCR扩增产物的高分辨率熔解曲线。结果得到的熔解曲线可根据受试者的CR1同种型表达表型进行区分。

如归一化并位移的熔解曲线以及归一化并温度校正的差异图两种展示方式所示，曲线图谱按照CR1 star three、CR1 star one组，CR1 star one、CR1 star two组，CR1 star one组，CR1 star two组，以及CR1 star two、CR1 star four组分布。这些曲线对应于CR1长度多态性等位基因。观看本视频后，您应能够充分理解如何根据HRM-PCR获得的理想曲线，简便地对CR1长度多态性进行基因分型。

通常，由于需要已知 CR1 长度基因型的参考样本，初次使用该方法的人可能会遇到困难。如果操作得当，掌握该技术后可在四小时内完成。在进行该实验时，务必注意每份 DNA 样本应使用相同的浓度。

在完成该实验步骤后，还可采用其他方法（如锥形DNA测序）来回答更多科学问题，例如发现一种新的已知私有单核苷酸多态性（SNP）。该技术的发展为群体遗传学领域的研究提供了途径，有助于探索病原体对CR1长度多态性的选择性压力。尽管该方法可为阿尔茨海默病发病机制中的易感性提供见解，也可应用于其他疾病的研究，如系统性红斑狼疮和疟疾。