高分辨率熔解PCR检测突变DNA序列中的序列变异

高分辨率熔解聚合酶链式反应（HRM-PCR）能够高精度地检测双链DNA（dsDNA）的序列变异。

从含有非活性Taq聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸（dNTPs）和荧光报告染料的预混液开始。加入正向和反向引物。将混合物用移液器加入PCR板的各孔中。

加入双链DNA模板。密封反应板，防止混合物蒸发。开始PCR反应。

高温变性使双链DNA解链为单链DNA（ssDNA），并激活聚合酶。随后反应体系冷却至退火温度，促进正向和反向引物与单链DNA结合。 通过 位点特异性的互补碱基配对

激活的聚合酶被招募，通过添加dNTP延伸DNA-引物双链体。

荧光报告染料——一种以饱和浓度存在的双链DNA特异性染料——插入整个双链结构中，产生强烈的荧光。该双链结构经历多个PCR循环，产生多个含有变异的片段。

PCR反应结束后，通过随时间稳步升高反应温度来进行熔解曲线分析。

根据核苷酸序列的不同，含有变异的位点可能会首先解链，从而释放染料。随着其余染料结合位点趋于饱和，染料无法重新嵌入，导致荧光强度降低。此外，双链DNA在逐步加热过程中会解离为单链DNA。

确定熔解温度，即双链DNA有一半变性为单链DNA并伴随荧光显著下降时的温度。扩增DNA片段熔解曲线的偏移可识别样本的核苷酸序列变异。

进行高分辨率熔解曲线PCR（HRM-PCR）实验时，首先将DNA样本加入1.5毫升离心管中，用水稀释至浓度为10纳克/微升。接着，将解冻的引物溶液用1.5毫升离心管加水稀释至6微摩尔/升的相同浓度。解冻HRM-PCR试剂盒中的各溶液，并通过涡旋振荡充分混匀，以确保完全回收所有组分。

在打开含有酶混合物、DNA结合染料、氯化镁和水的三个小瓶之前，先在微量离心机中短暂离心。在室温下，于1.5毫升离心管中，按照文本方案所述，使用上述组分配制用于120微升反应的PCR混合液。通过涡旋轻轻混匀。

您必须专注、有序地操作，并遵循分子生物学的良好实验规范。

用移液器将19微升PCR混合液加入白色多孔板的每个孔中。加入1微升浓度已调整的DNA模板，然后用密封膜密封白色多孔板。将白色多孔板在标准摆动桶离心机中以1500 × g 离心1分钟，离心机需配备适用于多孔板的转子及相应适配器。将白色多孔板放入HRM-PCR仪器中。根据文本方案中提供的PCR条件，启动HRM-PCR程序。

在完成HRM-PCR反应后，按照文本方案所述进行HRM分析，以确定CR1长度多态性。