提高疟疾高分辨率熔解单核苷酸多态性分型灵敏度的方法

以下高分辨率熔解实验的总体目标是提高对个体样本中低浓度突变等位基因的检测灵敏度。首先通过将提取的DNA模板稀释至所需体积和浓度来完成DNA的制备。第二步是采用不对称比例的正向与反向引物配制检测体系，以增加模板探针产物的生成。

在准备反应体系后，将退火温度设定在探针结合于野生型或突变型模板时熔解温度之间的范围内。最后一步是在相应的高分辨率熔解（HRM）平台上分析扩增产物。最终，通过突变等位基因扩增偏好性及基于探针的不对称PCR，可更灵敏地检测样品中低浓度下难以检测的SNP突变。

这种提高的灵敏度在群体突变监测中具有重要应用价值。与现有的标准高分辨率熔解曲线分析或TaqMan基因分型等方法相比，该技术的主要优势在于能够提高对低浓度等位基因的检测灵敏度，同时还能对基因组中位置相邻的SNP进行基因分型。尽管该方法可为了解疟原虫药物抗性传播情况提供重要信息。

它还可应用于其他系统，例如对其他类型的传染病（如艾滋病病毒）进行监测，或在细胞群体中检测罕见的癌症变异。演示该实验步骤的是我们实验室的技术员凯特琳·杜尔菲（Caitlin Durphy）。

高分辨率熔解（HRM）分析所用的模板可从直接采集自参与野外研究站点患者的恶性疟原虫样本中制备。样本可保存在滤纸上、快速检测试纸上，或作为红细胞沉淀保存；也可将样本进行体外培养适应性扩增。部分用于分析的标准实验室菌株可从疟疾研究与参考试剂资源中心订购。样本可从全血、红细胞或滤纸中提取，也可直接使用红细胞沉淀或培养物进行红细胞沉淀的直接扩增。

首先采用美国疾病控制与预防中心（Centers for Disease Control and Prevention）提供的方法，通过薄血涂片显微镜检查确定红细胞的寄生率。寄生率高于0.5%的红细胞需稀释400倍。在TE缓冲液中，每个5至10 µL的反应体系将使用三 µL稀释后的红细胞。由于存在变异，每次高分辨率熔解曲线分析（HRM）均必须包含阳性和阴性对照。

使用序列验证的 snip 基因型质粒或标准品，配制浓度为每微升10皮克至10纳克的稀释液，作为阳性对照。扩增反应中以PCR级水作为空白模板的阴性对照。首先配制引物和探针的10倍工作液。

相同的方案适用于使用96孔板、384孔板、八联管条或玻璃毛细管的检测。但为了本演示的目的，仅使用96孔板和玻璃毛细管。下表列出了基于封闭探针的HRM基因分型推荐的10×工作液浓度以及最终浓度。

为每个反应准备反应混合液。每个孔中加入1微升10倍工作浓度的正向引物、反向引物和探针，4至5微升HRM预混液，1微升模板，以及PCR级水，总体积为10微升。

对每根玻璃毛细管进行相同操作。盖好培养板和玻璃毛细管。基于培养板的扩增使用光学板封膜，基于毛细管的系统使用塑料帽。

确保覆盖完全，培养板和盖子完全密封并固定，以防止蒸发。扩增过程中，离心样品以去除气泡。

将板在台式离心机中以1,800 × g离心3分钟。将玻璃毛细管在迷你离心机中离心10至15秒。将反应板和玻璃毛细管放入热循环仪中，运行标准的封闭探针或MAAB扩增程序。PCR扩增完成后，通过系统软件界面进行熔解分析。

将反应板从 40 摄氏度加热至 80 摄氏度，以同时获得探针和扩增产物的熔解曲线峰。在 Light Cycler 480 上进行的第一步熔解分析，是通过观察归一化荧光信号对温度的负导数曲线进行归一化处理。移动归一化条，使其包围探针熔解区域。

探针熔解区域是两个熔解区域中温度较低的一个。归一化条应位于熔解峰的基部。归一化完成后，如有需要，选择“计算分组”以自动将样本分配至各组，或手动将样本重新分配至特定组别。

选择未扩增或熔解峰呈锯齿状的样本。然后进入“新建调用”并选择“阴性”。在选择所有剩余分类错误的样本后，进入“新建调用”，选择相应的分组，然后单击“应用更改”。根据标准为每组分配基因型。

在确认计算出的分组正确后，在分组选项卡下选择“编辑组名称”。将各标准品的基因型输入到对应的彩色框中。例如，若标准品 3D seven 已知为 C 基因型且位于第一组，则第一组中的所有样本基因型均为 C。点击“结果”后，基因型将显示在样本旁边。

最后，将结果导出为 TXT 文件，以便进行进一步的样本群体分析。在 Light Cycler 2.0 运行结束后，记录样本数据下的样本名称和位置。在开始分析前，标记阴性对照以及熔解标准品的基因型。通过选择“分析”，在熔解曲线分析中选择“基因分型”，然后按“确定”来开始熔解分析。

为提高自动分组的灵敏度，选择所有样本以在熔解曲线图中显示。将归一化滑块移至探针熔解峰的上边界。通过逐一选择分组名称下方的每个分组，确认样本已正确分组。

通过选择所有样本，复制数据并粘贴到工作表中，导出每个样本的基因型。通常，以归一化荧光强度对温度的负导数作图是可视化熔解峰并确定基因型的最直接方法。将分析窗口设置为仅包含探针区域，可清晰区分对应于特定单核苷酸多态性（SNP）的熔解峰。

完全匹配会产生红色显示的较高熔解峰。而当样本中同时存在两个等位基因时，单核苷酸多态性（SNP）错配则表现为灰色显示的较低熔解温度。基于探针的高分辨率熔解（HRM）分析将两个等位基因表现为两条橙色的峰曲线，其峰位置分别与红色和灰色显示的单等位基因样本相匹配。在扩增过程中逐步降低退火温度，会导致多基因组或多等位基因样本中突变等位基因的偏好性扩增，表现为左侧峰的增强。

这种突变等位基因扩增偏好性使得高分辨率熔解曲线分析（HRM）能够检测多基因组或多等位基因样本中低于1%的低频等位基因。在进行该实验时，需注意样本质量至关重要。缓冲液浓度的微小差异都可能导致HRM曲线发生偏移。

使用对照是标准化实验结果的有效方法。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用基于探针的不对称PCR和突变等位基因扩增偏好，从多种样本类型中准确且灵敏地对疟疾SNP进行基因分型。