化学修饰的肽核酸对双链RNA相对于单链RNA的序列特异性与选择性识别

本方法学文章的总体目标是介绍我们实验室用于研究化学修饰的肽核酸对双链RNA分子识别的详细实验方案。该方法有助于解答RNA化学生物学领域中的关键问题，例如RNA结构的检测与靶向。该技术的主要优势在于，其设计原理可适用于任何RNA双链结构的靶向识别。

本实验操作将由我实验室的研究助理 Desiree Toh 演示。开始实验时，向预先制备好的 RNA PNA 样品中加入 4 µL 的 35% 甘油溶液，并轻轻混匀。使用微量移液器和加样枪头，小心地将每份样品各 20 µL 加入预先制备的聚丙烯酰胺凝胶中，注意避免产生气泡。

以250伏恒定电压电泳运行五小时。五小时后，关闭电源，从电泳装置上取下玻璃板。然后移除凝胶封边胶带，并拆卸玻璃板。

轻轻将凝胶从玻璃板上取下，放入盛有 350 毫升去离子水的容器中。小心向容器中加入 35 微升溴化乙锭，并将容器置于平台摇床上，以低速摇动 30 分钟。弃去溴化乙锭溶液后，用 1.5 至 2 升蒸馏水冲洗凝胶。

然后使用配备532纳米绿色激光和610纳米发射滤光片的成像仪扫描凝胶。使用免费软件对凝胶条带强度进行定量。将适量的2-氨基嘌呤标记的双链RNA转移至洁净的1.5毫升离心管中。

然后使用真空浓缩仪浓缩RNA溶液。接着，从先前配制的主储备液中，将不同浓度的目标PNA分别转移至不同的1.5毫升离心管中。使用真空浓缩仪浓缩PNA溶液。

向含有干燥RNA的离心管中加入975微升孵育缓冲液，充分混匀以确保所有RNA完全溶解。短暂离心RNA溶液后，将离心管放入预热的加热金属块中，进行10分钟的退火处理。完成后关闭加热金属块，让样品冷却至室温。

向每个含有干燥PNA的离心管中加入75微升RNA，并充分混匀。室温静置至少一小时后，于4摄氏度孵育过夜。接着，将适量的2-氨基嘌呤标记的单链RNA转移至不同的1.5毫升离心管中。

从主储备液中吸取适量体积的目标PNA，按不同浓度分别加入含有单链RNA的各试管中。样品干燥后，向每支试管中加入75 µL杂交缓冲液，并充分混匀。将各试管置于预热的金属浴中孵育10分钟，进行退火处理。

待样品冷却至室温后，于4 °C下孵育过夜。随后，将每份样品中的70 µL转移至1 cm方形比色皿中。将比色皿放入荧光分光光度计，测量330至550 nm波长范围内的发射光谱。

测量完成后，从比色皿中移除缓冲液。用蒸馏水冲洗比色皿，并用氮气吹干。在对所有样品重复测量后，绘制荧光强度随波长变化的曲线图。

将适量的单链RNA转移至若干个1.5毫升离心管中。随后，从主储备液中吸取相应体积的目标PNA，分别加入含有单链RNA的各管中。样品干燥后，向每管中加入130微升孵育缓冲液，并充分混匀。

将每个样品置于预热的金属浴中孵育10分钟以进行退火。待样品冷却至室温后，于4摄氏度过夜孵育。随后，将每个样品中的130微升转移至八联微量比色皿中，其中一个孔加入孵育缓冲液作为对照。

使用紫外-可见分光光度计，在260纳米处测定每个样品的吸光度。以0.5°C/分钟的升温速率，从15°C升至95°C进行测定，随后以相同速率从95°C降温至15°C进行测定。PNA寡聚体经两次反相高效液相色谱纯化后获得。

可通过MALDI/TOF分析确认PNA的身份。非变性PAGE数据表明，Q和L修饰的PNA只能识别含有C-G碱基对的双链RNA区域。这种特异且增强的识别是通过T-A-U-L-G-C和Q-C-G PNA-RNA形成的两个三链结构实现的。

一项2-氨基嘌呤荧光滴定研究表明，含有Q和L修饰的PNA能够结合靶向的双链RNA，但不能结合单链RNA。含有Q残基的PNA未显示出热熔解转变，表明其无法与单链RNA结合，这是由于在类似Watson-Crick的Q-G碱基对中存在空间位阻。与未修饰的PNA P1相比，含有L残基的PNA P4和P5因其在类似Watson-Crick的L-G碱基对中存在空间位阻，导致相应的RNA-PNA双链体熔解温度降低。

紫外吸收检测的热变性数据与2-氨基嘌呤荧光滴定数据一致，后者同样表明含有Q和L残基的PNA不会与单链RNA强烈结合。引入Q碱基比引入L碱基更具有 destabilizing 作用，因为Q碱基在形成类似Watson-Crick的Q-G配对时会产生更显著的空间位阻。一旦掌握，若操作得当，各项实验可在一周内完成。

在完成该操作后，可进一步开展其他方法，例如在细胞内探测和靶向RNA结构，以回答更多问题，比如我们是否能够利用双链RNA结合型PNA来检测RNA结构并调控RNA功能。该技术一经建立，便为RNA生物学与疾病领域的研究人员探索以RNA结构为靶点的治疗开发铺平了道路。