体内单核细胞趋化活性的定量分析及血液单核细胞来源巨噬细胞的表征

该方法可使我们在活体动物中定量分析血液单核细胞的趋化活性，并研究不良饮食对单核细胞功能及其潜在机制的影响。可通过多种方法分离并分析单核细胞来源的巨噬细胞，包括单细胞和组学技术，这些技术可提供小鼠模型中血液单核细胞状态的健康快照。今天的实验操作将由我实验室的助理教授Dr. Young Joo Ahn和博士后Dr. Luxi Wang完成。

开始实验操作前，使用消毒剂清洁细胞培养罩，并将生长因子减少的基底膜衍生溶液置于冰上完全解冻。为各个无菌的1毫升注射器装配26号针头，并将针头放置于冰上。溶液解冻后，在向每个1毫升注射器中加入500 µL含有或不含趋化因子的溶液之前，先用酒精棉片擦拭基底膜衍生溶液小瓶的瓶口。

然后去除装有基底膜来源溶液的注射器中的任何气泡，以确保形成均匀的凝胶栓。在确认小鼠对脚趾夹捏无反应后，将不含MCP-1的基底膜来源溶液全部体积以每秒约100 µL的速度缓慢皮下注射至麻醉小鼠的右侧 flank。并将添加了MCP-1的全部500 µL基底膜来源溶液注射至动物左侧 flank。

注射后将注射器保持原位20至30秒，以防止溶液泄漏，并在将小鼠置于加热垫上进行监测直至完全恢复之前，形成一个完整、平滑的凝胶栓。注射三天后，去除注射部位动物背部的毛发，用镊子夹住下胸椎和上腰椎周围的皮肤。在皮肤上做一个长约2毫米的切口，然后从小鼠颈椎开始沿背部中线向下切割，直至尾椎连接处上方1厘米处。

将皮肤与肌肉层分离，并用大头针将皮肤固定在聚苯乙烯泡沫平台上。接着，在解剖显微镜下，用精细镊子小心夹住包裹基底膜来源凝胶栓的纤维囊，将其完整去除。然后使用精细剪刀清理凝胶栓。

然后将清洗后的基底膜来源凝胶块转移至已做好相应标记并称重的1.5毫升微量离心管中。重新称量离心管，以计算基底膜来源凝胶块的重量。进行基底膜来源凝胶块消化时，使用洁净的精细剪刀在每根微量离心管中将基底膜来源凝胶块剪碎，并向凝胶块中加入800 µL的displace溶液。

在最大转速下涡旋震荡10秒以破坏凝胶栓，随后将微量离心管置于37摄氏度的恒温混匀仪中，以每分钟1400转的速度孵育2小时，使来源于基底膜的凝胶栓完全溶解。孵育结束后，通过两次离心沉淀凝胶碎片，并将沉淀物重悬于300微升磷酸盐缓冲液（PBS）中。将每种细胞悬液各取50微升转移至新的微量离心管中，并向新管中的细胞加入0.5微升钙黄绿素进行标记。

在二氧化碳培养箱中于37摄氏度孵育10分钟后，使用自动细胞计数器对活细胞（绿色荧光阳性）和死细胞（无荧光）的数量进行计数。对于单细胞Western印迹分析，将1毫升稀释后的单细胞悬液加入置于10厘米培养皿底部的已水化单细胞Western印迹芯片中。5至15分钟后，在明场显微镜下观察芯片。

大约15%至20%的微孔应被单个细胞占据，少于2%的孔应含有两个或更多细胞。如果芯片已正确加载，则将培养皿倾斜45度，用悬浮缓冲液洗涤芯片三次，以去除未被捕获的细胞。最后一次洗涤后，小心地将芯片（凝胶面朝上）装入单细胞Western仪器的电泳槽中，并用裂解运行缓冲液完全覆盖整个单细胞Western印迹芯片。

根据相应的实验参数启动细胞裂解并运行仪器。运行结束后，在室温下用新鲜洗涤缓冲液对芯片进行两次冲洗，每次冲洗10分钟。第二次冲洗后，向抗体探针室中加入80微升目标一抗溶液，并将芯片凝胶面朝下放置，使抗体溶液沿芯片毛细扩散。

室温孵育两小时后，在摇床上用洗涤缓冲液洗涤芯片三次，再用水洗涤一次。在避光条件下，室温下用适当的二抗孵育芯片一小时。孵育结束后，用洗涤缓冲液洗涤芯片三次，并将芯片置于载片离心机上离心，以去除残留的洗涤缓冲液。

为了剥离单细胞 Western 杂交芯片，将一个 15 毫升离心管架放入 60 摄氏度的水浴中，水位略高于架子约 1 厘米。在通风橱内，向一个容器中加入 40 毫升剥离缓冲液和 320 微升 β-巯基乙醇。将芯片放入容器内的 10 厘米培养皿中，并用 Parafilm 密封容器。

然后将罐体放入水浴中的试管架内。90分钟后，小心地将芯片转移至新的培养皿中，并用洗涤缓冲液短暂清洗芯片一次，随后向培养皿中加入15毫升新鲜洗涤缓冲液，在摇床中洗涤15分钟。在此项代表性实验中，在注射后第1、3和5天分别计数各凝胶栓中募集的细胞数量。

通过从MCP-1加载的凝胶栓中的细胞数量中减去载剂处理的凝胶栓中的细胞数量，计算出特异性响应趋化因子招募的细胞数量。在五天观察期内，观察到MCP-1特异性招募和细胞积聚加快，招募速率从注射后第一天的每天31,000个细胞增加至注射后第五天的每天136,000个细胞。随后采用单细胞Western blot分析，根据所招募细胞对特定免疫细胞标志物的表达情况，鉴定被招募至基底膜来源凝胶栓中的不同细胞类型。

例如，在MCP-1负载的基底膜来源凝胶塞中，单核细胞的比例在第1天较低，第3天达到峰值，随后在第5天再次下降，而巨噬细胞的数量在整个研究期间持续增加。对于负载MCP-1的凝胶塞，分离细胞群体中单核细胞与巨噬细胞所占比例在第3天最高，表明在3天后，由MCP-1依赖性趋化作用募集的细胞绝大多数为单核细胞和巨噬细胞。尽管单核细胞与巨噬细胞的总数在第5天通常高于第3天，但第3天的细胞计数更能准确反映外周血单核细胞的趋化与募集情况，因此建议将第3天作为基底膜直接凝胶塞分析的时间点。

单细胞成功获取以用于下游分析，取决于注射的准确性和彻底清除凝胶塞。可通过流式细胞术、单细胞Western印迹、群体或单细胞RNA测序以及其他组学方法来评估所募集的单核细胞及其衍生巨噬细胞的特征和表型。