活体单神经元分辨率下新生小鼠感觉皮层自发活动的可视化

本研究的目的是探讨发育中的大脑皮层中神经回路的形成过程。我们旨在理解神经元活动在这一过程中的作用。近年来，双光子显微镜技术使得在活体动物中观察神经元回路的形成过程成为可能。

我们已开发出一种用于成像新生小鼠大脑皮层中单个神经元的方法。通过同时记录神经元的活动模式及其形态变化，我们将能够明确哪些活动模式参与了神经元靶点的形成。首先，将带有钛板的二维测角仪固定在显微镜载物台的阶段板上，以实现XY方向的精确定位。

启动扫描软件，使用20倍物镜，将像素设置为512×512双向扫描。完成颅窗手术后，将表达GCaMP的幼鼠置于加热垫上，使其大脑半球一侧朝上。使用螺钉将头部固定用的钛条牢固固定在钛板上。

然后，使用测角仪水平调节窗口角度。利用背光照射脑表面，并使用5倍物镜通过XY定位选择成像区域。在20倍水浸物镜下，向颅窗滴加眼药水。

关闭背光后，以单光子模式扫描脑表面。增加激光强度以观察来自玻璃和脑表面的绿色自发荧光。遮盖显微镜以防止外部光线干扰。

启动扫描软件并设置为双光子成像模式。随后校准激光功率和探测器增益，以最佳方式观察GCaMP信号。在含有大量表达GCaMP神经元的成像区域中定位深度，然后开始延时成像以捕获GCaMP信号。

双光子显微镜揭示了出生后第六天幼鼠桶状皮层中第四层神经元的活动，呈现绿色荧光。绿色GCaMP信号较强，导致信号渗漏至红色通道，并识别出14个感兴趣区域。首先，启动MATLAB并运行easy calcium工具箱，以进入初始图形用户界面。

在初始图形用户界面中，选择“运动校正”以打开运动校正图形用户界面。使用“添加文件”选项上传包含成像数据的 TIFF 文件。接下来，将非刚性运动校正设置为空白，上采样因子设为 50，最大位移设为 15，初始批处理大小和 bin 宽度设为 200。

单击“运行运动校正”以启动校正。在初始图形用户界面中，激活自动ROI检测以进入ROI检测图形用户界面。使用“添加文件”功能导入经过运动校正的成像数据。

将初始化设为贪婪算法，搜索方法设为椭圆法，解卷积设为约束性FOOPSI SPGL1，自回归设为衰减。然后，将估计的感兴趣区域（ROI）数量设为60。将估计的ROI宽度设为17，合并阈值设为0.95，修正因子设为0.95，空间和时间下采样设为1，时间迭代次数设为5次。

然后，单击“运行 ROI 检测”以启动检测过程。在初始图形用户界面中，选择 ROI 优化以启动 ROI 优化图形界面。使用“加载数据”按钮导入 ROI 数据。

选择位于颅骨下方且活动频率较低的 ROI，或与其他神经元的神经突重叠的 ROI。单击“排除 ROI”以在后续分析中排除这些 ROI。使用此公式计算 ΔF/F 值。

选择 XLSX 作为数据导出格式，并执行数据导出以生成包含原始 ΔF/F 值的 Excel 文件。计算各 ROI 之间 ΔF/F 值的皮尔逊相关系数，并构建相关系数矩阵。使用 Fiji 软件从 TCA-RFP 图像中勾画桶状结构的边界。

然后，将感兴趣区域（ROI）分配至其对应的桶状结构或隔膜。比较相同桶状结构内以及不同桶状结构间的两两相关系数。通过随机置换感兴趣区域位置与钙离子信号轨迹之间的关联，生成 1,000 至 10,000 组替代数据集。

在每组模拟数据集中，分别计算同一柱状结构内的平均相关系数，并确定该相关性的统计学显著性。结果发现，相同感觉处理单元内的成对相关系数高于不同单元之间的相关系数。尽管距离较长，同一单元内的神经活动表现出更强的同步性，其相关性超过了来自不同单元但物理距离更近的神经元之间的相关性。

相同桶内的相关系数平均值显著高于从10,000组替代数据计算出的相关系数平均值。在三个不同的时间窗口内，相同桶内的相关性均表现出显著强度。