在癌细胞系中条件性敲低基因表达以研究单核细胞/巨噬细胞向肿瘤微环境的募集

本实验方案的总体目标是利用在癌细胞中条件性敲低基因表达的方法，体外研究单核细胞和巨噬细胞向肿瘤微环境的募集过程。该方法有助于解答肿瘤微环境领域中关于癌细胞与免疫细胞之间相互作用性质的关键科学问题。该技术的主要优势在于所用系统仅需单载体克隆，可快速生成多个克隆株，并且表现出极低的毒性水平。

同时还展示了一种无需抗体直接接触即可纯化人单核细胞的方法，该方法可避免意外激活，同时获得纯度超过95%的人单核细胞群体。为产生病毒颗粒，使用转染试剂按照标准操作流程，将25微克pLKO-tet-on shRNA、25微克psPAX包装质粒以及5微克表达包膜的质粒pMD2.G共转染至70%融合度的150毫米培养皿中的HEK-293细胞。

将混合物加入150毫米培养皿中。次日，通过更换为添加了10毫摩尔丁酸钠和20毫摩尔HEPES的DMEM培养基，诱导细胞产生慢病毒。在37摄氏度和5%二氧化碳条件下培养8小时。

孵育8小时后，用PBS洗涤细胞，加入25毫升新鲜DMEM培养基（含20毫摩尔HEPES，不含丁酸钠）。继续孵育48小时后，用移液器小心收集含病毒的培养基。为建立稳定细胞系，首先将HCT-116结肠癌细胞和MDA-MB-231乳腺癌细胞以每孔50,000个细胞的密度接种至12孔板中。

在37摄氏度和5%二氧化碳条件下孵育。当细胞融合度达到60-70%时，用PBS洗涤细胞，并向每孔加入1毫升含病毒的培养基。次日，小心地通过抽吸去除含病毒的培养基。

然后用 PBS 洗涤细胞，加入含有无四环素胎牛血清的培养基。72 小时后，按前述方法洗涤细胞，并加入补充有 1 µg/mL 嘌呤霉素的培养基，以筛选病毒感染的细胞。通过在嘌呤霉素存在下培养细胞 3 至 14 天，完成对病毒转导细胞的筛选。

在病毒转导的细胞中，观察嘌呤霉素对部分孔中细胞的杀伤作用。未转导的细胞在嘌呤霉素存在下无法生长。当这些对照细胞死亡后，在抗生素存在下继续培养条件性调控的细胞系两周，以建立条件性调控的细胞系。

通过向嘌呤霉素抗性的HCT-116结肠癌细胞和MDA-MB-231乳腺癌细胞中加入含不同浓度多西环素的培养基，并培养72小时，验证条件性敲低的效率。制备细胞裂解液后，通过蛋白质印迹分析检测敲低水平。此处显示的是PAI-1的表达水平。

为分离外周血单核细胞，首先准备三个50毫升离心管，每管中加入15毫升密度梯度溶液。然后使用设置为重力流的移液控制器，将30毫升稀释后的血液缓慢铺加在密度梯度溶液上层。在室温下，使用水平转子以400 ×g离心25分钟，离心过程中不启用刹车。

离心后，弃去上层液体，将含有外周血单个核细胞的中间层转移至新的50毫升离心管中，并加入含FBS的PBS至50毫升。在室温下以120 ×g离心10分钟。离心结束后，移除含有血小板的上清液。

最后一次离心并收集后，将沉淀重悬于50毫升含胎牛血清（FBS）的PBS中，并使用血细胞计数板对单个核细胞进行计数。将细胞在120 ×g条件下离心后，用含有1毫摩尔EDTA的FBS-PBS缓冲液重悬沉淀，调整细胞终浓度为每毫升5000万个细胞。随后开始通过单核细胞富集步骤：每毫升细胞悬液中加入50微升阴性选择抗体混合物，并充分混匀。

室温孵育10分钟。孵育结束后，每毫升加入50微升磁珠，混匀后再次孵育10分钟。然后加入含FBS和EDTA的PBS缓冲液至25毫升，将外周血单个核细胞混合液置于可容纳50毫升离心管的磁力架中。

室温孵育10分钟后，磁珠将附着于管壁，并将非单核细胞从溶液中分离。使用25毫升移液管小心吸取含有单核细胞的溶液，注意移液管不要接触管壁。离心并去除上清液后，将含有单核细胞的沉淀重悬于含10%无TET胎牛血清和1%青霉素-链霉素的RPMI培养基中。

实验开始时，在24孔板的每个孔中以0.5毫升体积接种40,000个HCT-116或MDA-MB-231细胞，每组设三个重复孔。次日，在孔中加入滤膜。然后将8,000个单核细胞以0.3毫升体积接种到置于癌细胞上方的经BSA处理的多孔膜小室上，并在37°C和5%二氧化碳条件下培养。

48 小时后收集插入物。轻轻振去多余的培养基，用棉签精确擦拭内表面，以去除未迁移的细胞。使用 Wright-Giemsa 染色法对外侧的插入物进行染色。

将滤膜上的迁移巨噬细胞面朝上固定后，使用20倍物镜的光学显微镜观察切片。每张滤膜拍摄九个视野的图像，并计数所有视野中的迁移巨噬细胞。采用Boyden小室实验定量分析单核细胞向癌细胞迁移的能力。

在 MDA-MB-231 乳腺癌细胞存在的情况下，向共培养体系中添加强力霉素以下调 PAI-1 表达后，单核细胞的迁移受到 33% 的抑制。在 HCT-116 结肠癌细胞存在时，该抑制效应更为显著，通过给予强力霉素敲低 PAI-1 后，单核细胞迁移减少了 74%。当将经强力霉素处理的癌细胞条件培养基置于孔板底部作为趋化因子来源时，也观察到了类似结果。观看本视频后，您应能够充分掌握如何利用功能性 Tet-On 系统在人源癌细胞系中实现基因表达敲低，以研究癌细胞分泌的蛋白 PAI-1 对人单核细胞的趋化作用。