使用数字全息显微镜（DHM）定量低浓度微生物

本实验的总体目标是展示如何利用数字全息显微技术检测极低浓度的微生物。该技术比传统光学显微镜更灵敏，可提供关于细菌行为的实时信息。该方法有助于回答生物学和宇宙学领域的关键问题，例如在水中搜寻致病性微生物，或在冰冻卫星上探索太阳系内的生命迹象。

该技术的主要优势在于，数字全息显微术（DHM）是一种三维成像技术，这意味着我们能够瞬时获取样品的三维信息，而无需进行物理调焦。该技术的应用前景包括血液或脑脊液感染的诊断，因为它具备检测低浓度细菌的能力。开始实验时，在实验当天，对细菌主培养物进行分光光度读数，预期其值在0.6至0.7范围内。

然后取一份主培养物样品，使用Petroff-Hausser计数板直接计数细胞，以统计活细胞和死细胞数量。用微量移液器吸取10 µL未稀释的培养物样品加入计数板中。在显微镜下使用高倍干镜并结合相差显微镜观察成像。

随后，计数至少20个方格中的细菌数量并取平均值。将20个方格的平均值乘以稀释倍数，计算出细菌浓度。若仅需计数活菌，可使用无菌0.9%生理盐水对所选细菌样品进行系列稀释：取20 µL细菌溶液转移至另一孔中，加入180 µL生理盐水进行稀释。

重复该步骤，直至最低浓度约为每毫升10³个细胞。接着，从至少两个稀释度的样品中各取100微升，接种到相应的固体培养基平板上。用无菌涂布棒涂布均匀，并对每个稀释度至少进行三次重复。

随后，在适当的温度下孵育过夜，或直至菌落生长出来。然后计数菌落。计算菌落形成单位，并对重复实验的结果取平均值。

在此步骤中，对主培养物进行系列稀释，用于在溶菌肉汤培养基平板上测定 DHM 及 DHM 后的菌落形成单位（CFU）。将细菌稀释至 25 毫升最低培养基中，该培养基可促进细菌运动性但抑制细胞分裂，从而使实验过程中细胞浓度无明显变化。为记录 DHM 视频，使用无菌注射器吸取约 10 毫升所需稀释度的菌液。

然后使用无菌接头和管路将注射器连接至DHM样品室。通过注射泵使样品从注射器持续流经样品室。当样品流经样品室时，以适当的帧率连续采集全息图。

确保留出足够时间，使全部10毫升样品流经DHM。为保证实验过程中细菌既不生长也不死亡，可在DHM成像完成后，取100微升用过的培养基，用无菌涂布棒均匀涂布于增菌培养平板上进行接种。随后在适当温度下培养24小时，再进行菌落计数。

获得准确的细胞计数对于定量确定检测限至关重要。必须使用校准过的微量移液器小心进行所有稀释操作，并通过光密度测定、平板计数以及Petroff-Hausser计数板直接计数来确认所有细胞数量。为了分析获取的全息视频中细菌的存在情况，首先将图像转换为32位格式，然后进行培养基背景减除滤波处理。

然后计算像素的中位数值。最后，从每个相应像素中减去该中位数值，以消除全息图中的静态伪影。之后，手动计数可见区域环的数量以及处于焦点内的细胞数量。

每组全息图将附带一个时间戳文件。利用该时间戳文件计算图像捕获时刻所泵入样品的总体积。随后，通过将检测到的细胞总数除以成像样品的总体积，计算细胞密度。

为获得准确的统计数据，需取五到十个视野的平均值。本图显示了基于365微米×365微米×1毫米样品体积所预测的每视野细胞数。当每视野细胞数少于一个时，需要采集多张图像才能实现检测。

这是通过平板计数法测定浓度为每毫升2,100个细胞的粘质沙雷氏菌培养物的数字全息显微镜（DHM）全息序列。该序列大约每一到两秒显示一个细胞，与预测结果高度吻合。这是另一段通过平板计数法测定浓度为每毫升620个细胞的粘质沙雷氏菌培养物的DHM全息序列。

该序列每大约六到七秒显示一个细胞。使用数字全息显微镜对细胞进行成像时，请务必在配制所有溶液时采用滤膜除菌技术，以避免将颗粒物引入仪器中。

在进行该实验操作时，重要的是要记得准备健康的细胞培养物，并备好额外的培养基、培养板和运动性培养基。完成该操作后，可进一步采用荧光染色等其他方法，以回答更多问题，例如活细胞与死细胞所占的比例。该技术建立后，为微生物学领域的研究人员探索培养细胞及环境样品中的三维运动性奠定了基础。

观看本视频后，您应能充分理解如何利用全息显微镜对细菌进行计数，并通过其他计数技术验证结果。请务必注意，操作细菌培养物可能具有极高危险性。在培养和处理活体生物时，应始终采取适当的生物安全防护措施。