定量光学显微镜技术：利用标准光学显微镜测量细胞生物物理特性

本实验的总体目标是利用标准光学显微镜和图像处理技术，对生长在玻璃盖玻片上的细胞样本进行质量与体积等基本物理特性的定量分析。首先将培养在玻璃盖玻片上的细胞样本装载到显微镜载玻片上，随后获取明场和微分干涉差（DIC）的多焦平面图像。

然后将每组Z轴图像序列分别输入到独立的MATLAB图像处理程序中，以提取物理数据。最终，通过明场对比和微分干涉差显微镜下的焦平面强度测量，获得细胞样本的基本物理特性。该技术相较于荧光显微镜等现有方法的主要优势在于，细胞样本无需固定、透化或染色。

该方法有助于回答细胞生物学领域中的关键问题，例如细胞周期中亚细胞密度是如何组织的，或在导致疾病状态的不同细胞群体中亚细胞密度有何差异。使用具备微分干涉差（DIC）和明场成像功能的显微镜，并根据文本方案中的附加规格，首先打开载玻片成像软件，创建一个新的载玻片用于图像采集。接着，打开对焦窗口，在滤光片组部分选择DIC。在显微镜控制标签页的聚光镜部分，将孔径滑块调节至最右侧位置。这将提供高数值孔径的照明，增强样本的光学切片效果。

采集样品的微分干涉差（DIC）图像序列后，打开对焦窗口并选择“打开”。在滤光片组部分，将孔径滑块向最左侧调节至完全关闭位置，以提供低数值孔径（NA）照明。调节信号强度后，打开图像采集窗口。

从DICZ堆栈采集获得的3D捕获设置将显示在图像采集窗口的滤光片组部分。勾选打开的复选框，并指定曝光时间。在图像信息部分，为图像命名，然后选择“开始”以启动Zack图像采集。

然后根据文本协议导出Z层图像，以便在名为JoVE HT DCO V one M的H-T-D-I-C MATLAB程序中进行体积测量。在“0节”中，通过从资源管理器中复制并粘贴包含hilbert_transform_D_M和sobel_edge_detect_M文件的目录路径，更新dependencies_directory变量（位于dependencies_directory = 后面的单引号之间），然后执行joco HT DCO V one M程序的0节部分。

在第一部分，通过复制并粘贴包含点 TIF 格式焦平面序列图像的目录来更新图像目录。单引号之间的内容仅需运行一次，以对图像进行对齐和旋转。对于希尔伯特变换，请运行代码的第二部分，此时将出现一个名为“定义 HT DIC 参数”的对话框。

然后输入样品DIC图像处于焦平面上的焦平面编号、横向分辨率、轴向分辨率、进行希尔伯特变换所需的DIC图像旋转角度，最后输入感兴趣区域的大小。然后点击“确定”。将显示由焦平面编号指定的DIC焦平面图像，并带有蓝色框。

将方框置于目标特征（如细胞）上方。当方框定位至目标区域后，在 B 区域内双击。图像的对比度应调整至暗部特征显示在左侧，亮部特征显示在右侧。将蓝色方框拖动至感兴趣区域，并根据需要调整其形状。

接下来，在第三节中，为了生成一个矩形掩膜，请取消注释第167行并注释第170行，然后通过在图像上单击并拖动鼠标来开始定义矩形掩膜区域。随后双击该矩形框以确认接受。若要生成手绘掩膜，请在执行第三节前注释第167行并取消注释第170行，通过单击并用鼠标绘制所需掩膜形状，绘制完成后双击掩膜以确认接受。运行第四节后，按照文本协议运行第五节以构建希尔伯特变换后的图像序列。

为了优化程序生成的感兴趣区域的 xz 横截面图像的图像分割效果。程序生成的图 500 显示出三种不同类型的对比度。算法成功识别细胞边界的程度取决于所用掩膜与程序第 2、2、9 行中阈值的组合；起始阈值设为 0.5，通过调整阈值并重新运行该部分程序，直至某一列中获得理想的轮廓效果为止。

如果在DIC分割中第一列的轮廓效果最佳，则使用第六部分来确定体积。如果第二列结果最优，则运行第七部分，基于希尔伯特变换的DIC图像确定细胞体积。如果第三列结果最优，则在运行第八部分时使用经前向滤波的希尔伯特变换DIC图像，以在NIQ PM MATLAB程序中进行质量测量，该程序标题为JO VCO NI qpm V1 M。在第零部分下，运行第一部分后，更新三个目录依赖项：BRIGHTFIELD和DIC目录的位置。接着运行第二部分，在标题为“define N-I-Q-P-M parameters”的对话框中，输入样本明场图像处于焦平面的焦平面编号、横向分辨率、轴向分辨率以及感兴趣区域的大小。

然后点击“确定”。将显示由焦平面编号指定的明场焦平面图像，并带有蓝色方框。如有必要，可通过重新运行第二部分来调整焦距，然后拖动方框在图像中移动，选择方框的节点并拖动以调整其大小，最后在方框内双击以确认。

在完成第三部分操作生成明场图像序列后，运行第四部分以生成相位图、伪微分干涉差（DIC）图像，并与明场图像以及真实的DIC图像进行对比。当伪DIC图像与真实DIC图像尽可能相似时，运行第五部分A或第五部分B，以允许用户勾画细胞轮廓，从而生成细胞的质量密度图、总质量以及正确的细胞密度直方图。在全焦图像采集过程中，样品的照明条件对于成功实施N-I-Q-P-M和H-T-D-I-C算法至关重要。本图展示了在DIC和明场成像模式下，针对聚苯乙烯微球和人结肠直肠腺癌细胞系SW620，分别采用低数值孔径（NA）和高数值孔径（NA）照明的情况。

这些图示展示了N-I-Q-P-M的最佳成像效果，以及HT DIC的最佳成像效果。这些图像展示了NIQ PM算法对参数的依赖性，突显了算法在成功与不成功实现情况下的表现差异。此处我们探究直径为4.8 µm的聚苯乙烯微球的相位分布。

预期的轮廓在理论上是已知的，因此可直接与NIQ PM重建结果进行比较。这些图版展示了在球体边界及内部均存在衍射效应的情况下，所能获得的最佳重建效果，但由于球体各点的重建稳定性受到限制，无法实现完全稳定的重建。如图L所示，对于相位特性未知的细胞样本，球体中心区域可通过N-I-Q-P-M方法重建，误差百分比为1%至5%。

先验信息可通过结合NIQ PMM方法与一种将伪DIC图像与实际DIC图像进行比较的程序来重建。N-I-Q-P-M方法有一个自由参数，即计算所围绕的右侧视野图像堆栈中的平面。

应调整该中心焦平面，直至伪微分干涉（DIC）图像与真实DIC图像尽可能相似。图中展示了使用0.9照明数值孔径（NA）拍摄的细胞的离焦伪DIC图像、最佳伪DIC图像及其对应的DIC图像。有趣的是，最佳相位图及相应的伪DIC图像并不一定对应于焦内的明场图像，如本图各面板所示。

最后，此处展示了在数值孔径（NA）等于0.9的照明条件下，从微分干涉差（DIC）聚焦图像序列中应用H-T-D-I-C图像处理算法所涉及的步骤：首先对DIC图像进行希尔伯特变换，以去除图像的基底浮雕背景。该过程会沿光轴方向引入一定程度的模糊，可通过高通滤波予以消除。经过处理的最终图像可轻松实现分割，从而确定样本各个横截面上的面积，进而推断出细胞的总体积。

在进行该操作步骤时，重要的是要记住明场或微分干涉对比成像的正确照明条件。此外，还可采用荧光显微镜等其他方法，通过将牵引力与样品的密度图进行共定位分析，以回答更多科学问题。