用于临床应用的人尿中3-硝基酪氨酸的微型固相萃取与液相色谱-串联质谱检测整合方法

本微型固相萃取联合液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）检测方法的总体目标是准确测定人尿液中游离的3-硝基酪氨酸，用于临床应用。游离3-硝基酪氨酸的含量可提供氧化应激的生物标志物信息。然而，由于现有方法灵敏度不足、选择性差以及样品前处理繁琐，在生物样本特别是临床紧急情况下准确测定3-硝基酪氨酸仍面临特殊挑战。

该技术结合高效的固相萃取与高灵敏度的液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析，可在无需衍生化及二维液相色谱的条件下，快速、特异且准确地测定人尿液中低水平的内源性3-硝基酪氨酸。尽管该方法可用于氧化应激研究，也可应用于其他病理状态，如复杂的炎症性和神经退行性疾病。由于抗氧化剂可降低3-硝基酪氨酸水平，该技术的应用还可拓展至监测抗氧化治疗的效果。开始实验前，将预先配制并解冻的尿液样本、标准品和质控样本涡旋混匀。

涡旋混匀后，将每种样品和标准品各250微升加入洁净的2毫升96孔收集板的32个孔中。除双空白样品孔外，向其余每个孔中加入50微升预先配制的内标工作液。然后向双空白样品孔中加入50微升含0.01%甲酸的液相色谱-质谱级水。

随后，向各孔中加入 250 µL 含 0.1% 甲酸的 LC-MS 级水。然后使用八通道移液器将溶液混匀三次，并用盖板密封，直至进行固相萃取上样。接下来，将混合模式阳离子交换 96 孔萃取微孔板和收集储液板置于正压处理器上。

利用混合模式阳离子交换微孔板进行固相萃取，可在单次提取过程中同时实现样品净化和3-硝基酪氨酸的富集。通过向吸附剂中加入200微升液相色谱-质谱级甲醇来活化萃取板。调节正压处理器上的压力调节旋钮，以设定较低的正压，使混合物缓慢流经吸附剂，必要时可调整压力。

通过将200微升含2%甲酸的液相色谱-质谱级水溶液流经吸附剂，进行平衡。使用八通道移液器，小心地将每份预混样品的全部体积加载至已预处理的萃取板上。在正压处理器上设置较低的正压，使混合物缓慢流经吸附剂，并根据需要调节压力。

随后，将含有2%甲酸的200微升液相色谱-质谱级水溶液通过吸附剂以洗涤小柱。用200微升甲醇和水洗涤后，将正压处理器调至高压，以干燥小柱。小柱干燥后，将储液槽更换为洁净的2毫升96孔收集板。

现在，加入50 µL的25 mmol/L乙酸铵溶液，缓慢洗脱萃取板上保留的分析物和内标物。然后加入50 µL含5%甲酸的液相色谱-质谱级水，以中和洗脱液。使用温和的乙酸铵溶液洗脱3-硝基酪氨酸，可显著提高选择性和灵敏度。

使用八通道移液器将样品混合三次，为液相色谱串联质谱分析做准备。设置好LC-MS/MS仪器后，使用液相梯度洗脱使3-硝基酪氨酸LC-MS/MS方法平衡10分钟。通过方法平衡，液相梯度将恢复至初始梯度洗脱条件。

自动进样器温度将设置为4摄氏度，烘箱温度将设置为30摄氏度。创建一个包含尿液样本、标准品和质控样本的批处理列表，然后通过进样已制备的样品启动批处理。

完成所有注射后，通过3-硝基酪氨酸与内标峰面积比值对名义上的3-硝基酪氨酸浓度进行线性回归，建立标准曲线，用于3-硝基酪氨酸定量，标准曲线浓度范围为每毫升10至2,500皮克。最后，使用所建立的标准曲线对所有其他样品进行定量，并确定质控样品是否落在既定范围内。人尿液样品的液相色谱数据显示，在优化条件下，3-硝基酪氨酸在色谱上与其他结构相似的酪氨酸类似物得以分离，消除了因这些大量存在的化合物共洗脱而产生的干扰，从而提高了检测方法的选择性。

在双空白样品的多反应监测色谱图中未观察到3-硝基酪氨酸信号，表明在整个过程中未生成3-硝基酪氨酸。此处展示了健康个体中3-硝基酪氨酸及其内标物的代表性多反应监测色谱图。在3-硝基酪氨酸和内标物的保留时间处未观察到干扰信号。

此处展示了一条典型的标准曲线。检测限定义为信噪比大于三的最低浓度，确定为每毫升两皮克。定量下限确定为每毫升10皮克，定义为精密度和准确度偏差在20%以内且信噪比大于10的最低浓度。

经过精细优化的整合检测方法在降低基质效应、吸附剂用量和废液处理的同时，显著提高了特异性、灵敏度和通量。该检测方法简单快速，可在24小时内完成尿液样本的处理，加之尿液采样具有无创性和低成本的优势，极具应用价值。

这种显著改进的方法非常适用于在临床前和临床研究中评估3-硝基酪氨酸作为氧化应激生物标志物的作用。