通过高分辨率熔解分析在水稻TILLING群体中鉴定突变位点

对于那些在技术上难以或成本较高的性状鉴定而言，该方法将非常有用，例如抗病性、矿物质含量等。这是一种相当简单、经济高效且高通量的技术。首先，将四个叶片圆片放入96孔PCR板的每个孔中。

向每个孔中加入 50 毫升缓冲液 A 溶液。将培养板置于 -80 °C 冰箱中冷冻 10 分钟。然后在室温下解冻培养板。

在95摄氏度下孵育10分钟。向每个孔中加入50 µL缓冲液B，并通过涡旋充分混匀。在1,500 ×g条件下离心微孔板1分钟。

将上清液作为DNA用于PCR。首先，使用一个孔中的DNA上清液作为PCR模板，以优化退火温度。将试剂和一微升DNA上清液加入每个PCR孔中。

将PCR管放入具有梯度功能的热循环仪中，并根据论文调整加热程序，以确定每个目标片段的最佳退火温度。对PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，以检测扩增片段。确定能够实现目标片段特异性扩增的最佳退火温度。

进行高分辨率熔解（HRM）分析时，将试剂混合，每孔加入1微升10倍浓度的荧光染料和1微升DNA上清液至适用于HRM的PCR板中。每块板中需包含一个野生型亲本样本和一个不含DNA的阴性对照。每孔加入一滴矿物油，以防止蒸发。

然后，用粘性封膜密封反应板，并在1,000 × g条件下离心1分钟。使用优化的退火温度运行PCR。随后，移除反应板上的粘性封膜，将反应板放入高分辨率熔解（HRM）仪中。

在软件中，从文件菜单选择“新建运行”，或按屏幕顶部的“运行”按钮。设定熔解温度范围，从 55 到 95 摄氏度。选择用于高分辨率熔解分析的样本，并排除与阴性对照相似的样本。

将熔解曲线归一化，使其具有相同的起始和终止荧光值。目视确认较低的最小值和较低的最大值温度光标位于曲线的相应区域。将荧光差值（delta F）保持在默认设置 05。

从标准品选择列表中，选择常见型与变异型，并选择正常灵敏度。选择 H12 以将野生型作为对照。ΔF 值大于 05 的样本被认为含有突变植株。

然后，采用CTAB法从突变体群体中提取熔解曲线与野生型显著不同的四种植物的DNA。使用分光光度计定量后，用NanoDrop 2000将DNA浓度调整至最终约为25纳克/微升。向PCR管中的DNA样本加入0.4微升PCR引物，放入热循环仪中，并调整程序以扩增目标片段。

然后，将PCR产物送至公司进行测序。经Sanger测序后，通过比较M2植株与野生型之间的序列来确定分子突变位点。本研究中，对M2幼苗进行HRM扫描及OsLCT1或SPDT基因突变分析，结果显示大多数样本的熔解曲线与野生型无显著差异，ΔF小于0.5。

在90至92摄氏度和81.5至83.5摄氏度的温度下，突变体表现出显著不同的HRM曲线，其delta Fs均大于05。通过测序色谱图确认了来自4,560株M2幼苗的基因上突变类型及位置。在OsLCT1基因的4,304个碱基对处鉴定出一个G到A的杂合突变位点。

在 OsLCT1 的第 4,240 个碱基对处出现了一个单核苷酸 A 插入，在 SPDT 的第 5,948 至 5,950 个碱基对位置观察到一个 TTC 三核苷酸缺失。我在高分辨率熔解曲线分析前对 PCR 进行了优化。凝胶中的染料具有一定的危害性。

运行凝胶时请记得戴上手套。