利用微流控装置测量单个出芽酵母细胞的寿命和细胞表型

本实验的总体目标是制备一种专用的微流控装置，并利用它来测量单个酵母细胞的寿命及其细胞表型。该方法有助于回答酵母衰老研究领域中的一些关键问题，例如：为何母细胞会衰老并死亡？哪些早期分子事件导致了细胞稳态的丧失，最终引发细胞衰老与死亡？该技术的主要优势在于，我们能够同时追踪母细胞、其寿命以及多种分子标记物，从而寻找与寿命相关联的分子事件。

尽管该方法可为研究酵母衰老提供见解，也可应用于其他领域，例如监测需要对多代细胞进行检测的参与性次级反应。通常，初次接触该方法的研究者会遇到困难，因为微流控装置的制备、细胞加载以及显微镜的设置均需大量练习才能成功操作。事先对该方法进行演示至关重要，因为将酵母正确加载至微流控装置中具有较大难度。

首先，按照随附文本方案中所述的标准技术，制备用于该装置的硅晶片模具。将模具有结构的一面朝上放入一个15厘米的培养皿中。使用胶带将模具固定在培养皿上。

接下来，将一个洁净的称量皿放在天平上，并对天平去皮归零。向称量皿中倒入 50 克 PDMS 基液，然后加入 5 克 PDMS 固化剂。使用一次性移液管搅拌 PDMS 基液和固化剂。

从称量舟的边缘开始，缓慢向内移动。充分搅拌混合物数分钟，直至混合物中形成细小气泡。将混合物缓慢倒入培养皿中，使其完全覆盖硅片模具。

然后将培养皿置于真空环境中10分钟，以去除PDMS混合物中的所有气泡。若从真空环境中取出后混合物表面仍有气泡残留，可用移液器将气泡吹除。接着，将装置在75°C条件下烘烤2小时。

当冷却至室温后，小心地沿模具周围的PDMS切开，然后轻柔地将聚合后的PDMS层从硅片模具上剥离，避免对硅片模具结构造成任何损伤。将PDMS层放置在实验台上，使带有图案的一面朝上。使用单刃工业剃刀刀片小心地切割出单个芯片，每个芯片边缘需保留足够的余量，以避免损伤芯片结构。

将带有图案的一面朝上，使用打孔笔垂直穿过通道两侧的入口和出口圆圈进行打孔。通过再次将打孔笔的针头插入每个孔中来检查孔道，确保针头能从另一侧穿出，表明无堵塞。

接下来使用胶带清除PDMS顶面的灰尘颗粒和碎屑。此步骤至少重复三次，并在PDMS上保留一段干净的透明胶带，以维持表面无尘。然后将装置翻转，对PDMS的另一面重复上述操作。

这一侧的最后一段胶带也保留。现在准备一个玻璃表面作为装置的基底。选择一块尺寸为 24 毫米 × 30 毫米、厚度在 13 至 17 毫米之间的盖玻片。

用70%乙醇喷洒玻璃表面，并用除尘剂干燥以对表面进行灭菌。然后将盖玻片和PDMS转移至塑料培养皿中。从PDMS上去除透明胶带，并将带有图案的一面朝上放置在培养皿中，避免接触上表面。

然后将培养板放入等离子体腔室中。对PDMS和盖玻片进行氧气等离子体处理，使表面具有亲水性。随后将培养板从等离子体腔室中取出，并小心地将PDMS与盖玻片经等离子体处理后的表面贴合。

确保PDMS与盖玻片之间无气泡。最后，将装置转移至烘箱中，在75°C下烘烤至少两小时。在制备PDMS芯片前一天，将输入和输出管路浸入70%乙醇溶液中。

第二天，用5毫升注射器吸取灭菌水，将每根管子套在注射器上，用水冲洗管子。重复冲洗步骤至少三次，以去除残留的乙醇。接着在光学显微镜下检查PDMS通道。

使用10倍物镜确保结构一致且完整。用透明胶带将完整的PDMS芯片固定在显微镜载物台上。将装有无菌水的5毫升注射器连接至注射泵，并将相应的进样和出样管路插入装置中。

将流速设置为每小时 750 微升，并冲洗芯片约 10 分钟。观察通道，确保所有气泡被冲洗干净。若 10 分钟冲洗后仍有气泡残留，请手动调节流速以消除气泡。

将1毫升制备好的酵母样品转移至两支1.5毫升微量离心管中，在3,000 × g条件下离心5分钟。弃去每管中的大部分上清液，并将剩余部分合并，形成5毫升样品。酵母样品准备就绪后，从PDMS芯片上取下进样管。手动反转注射泵，依次在每根进样管中吸入一段长度为1至2厘米的小气泡，然后吸入细胞培养液。

然后将进样管重新插入PDMS芯片中，并重新启动泵，以750微升每小时的速度加载细胞。保持注射泵运行10分钟，随后在显微镜下观察细胞加载情况。成功的加载应使超过60%的悬柱下方捕获到细胞。

为了维持酵母细胞的生长，将注射器中的溶液更换为营养液，并将流速调整至每小时 400 微升。通过计数每个被捕获的母细胞产生的芽体数量，并估算 Kaplan-Meier 生存曲线，可获得酵母的寿命表型。采用本方案，装置可频繁捕获已捕获细胞新分裂出的子代细胞。

这些细胞随后会转变为新的母细胞，可通过下游图像分析软件进行识别。这些新的母细胞可提供更准确的寿命测量结果。在本实验中，新母细胞的平均寿命略长，大约多出两个世代。

除了出芽数量外，还可以从成像数据中提取连续两次出芽事件之间的时间间隔。随着细胞寿命接近终点，出芽频率会显著减慢，表明这些衰老细胞处于不健康状态。在进行该操作时，需注意使用新制备的芯片以避免产生气泡，同时可根据需要提高细胞浓度，以提升细胞加载效率。

该技术开发后，为酵母衰老领域的研究人员探索导致衰老表型的早期分子变化提供了可能。观看本视频后，您应能够充分理解如何制备这种微流控装置，以及如何利用它来测量单个细胞的寿命和细胞表型。