一种用于长期培养与成像的简易微流控芯片 秀丽隐杆线虫

该技术的主要优势在于，动物可以在装置内自由生长，并可被捕获以进行高分辨率成像。该装置可多次重复使用。在制作装置时，清洁度是最重要的因素，以确保制备出无尘的装置，避免在装置运行过程中发生泄漏。

使用文字处理软件，采用矩形形状设计流体层的图案一和控制层的图案二，并借助激光绘图仪将光掩模打印在聚酯薄膜上，最小特征尺寸为八微米。将硅晶圆切割成高和宽均为2.5厘米的方形片。用20%的氢氧化钾清洗一分钟，然后用去离子水冲洗晶圆。

使用一个晶圆作为流体层，另一个作为控制层。先用14 P-S-I的压缩氮气吹干晶圆碎片，然后在加热板上120摄氏度条件下脱水干燥四小时。冷却后，取一片硅片，将其放置在匀胶机的卡盘上，并开启真空以固定晶圆。

取约 20 微升六甲基二硅烷置于硅片上，使用匀胶机以 500 转/分钟旋转 5 秒，随后以 3000 转/分钟旋转 30 秒进行涂覆。为获得针对流体层、厚度约为 40 微米的均匀光刻胶层，取约 1.5 毫升负性光刻胶一，使用匀胶机以 500 转/分钟旋转 5 秒，随后以 2000 转/分钟旋转 30 秒，涂覆于硅片上。对第二片硅片重复六甲基二硅烷和负性光刻胶一的涂覆步骤，以获得针对控制层、厚度约为 40 微米的均匀光刻胶层。

或者，为了使较年老动物的流动层厚度增加至约80微米，可在硅片上涂覆约1.5毫升的负性光刻胶二，使用旋涂仪以500转/分钟旋涂5秒，随后以2000转/分钟旋涂30秒。将先前涂有光刻胶的硅片置于热板上，在65摄氏度下烘烤1分钟，随后在95摄氏度下烘烤10分钟。冷却后，将软烘后的硅片放置于紫外光照仪的曝光台上，使涂有光刻胶的表面朝向紫外灯。

分别将两块样品通过带有图案一和图案二的光掩模，使用200瓦灯泡进行紫外线照射15秒，以分别获得流体层和控制层。将曝光后的两块硅胶样品按先前所述方法烘烤，涂覆层朝上。冷却后，将硅胶样品浸入光刻胶显影液中20分钟，以显影出相应图案。

当图案可见后，用纯异丙醇冲洗各部件，并用氮气轻轻吹干。将硅胶部件放入干燥器中，使涂层表面朝上。通过在玻璃载片上滴加50微升纯T-C-P-F-O-S，使部件暴露于硅烷蒸气中。

将载玻片放入干燥器中，孵育两小时。在塑料杯中将弹性体基质与固化剂混合，制备PDMS，并持续搅拌三分钟。将PDMS混合物置于干燥器中脱气30分钟，以去除所有气泡。

将控制层硅片放入培养皿中，并在硅片上浇注一层5毫米厚的聚二甲基硅氧烷（P-D-M-S）混合液。浇注P-D-M-S后，再次对P-D-M-S混合液进行脱气处理。将带有流体层的硅片置于匀胶机载物台上，并施加200至500毫托的真空压力。

在硅片上倒入约一毫升的P-D-M-S。使用旋涂机旋涂，形成约80微米厚的涂层。将经旋涂和直接浇注P-D-M-S的两片硅片置于热对流烘箱中，在50摄氏度下烘烤六小时。

冷却后，使用锋利刀片从硅片周围控制层外切割下五毫米厚的P-D-M-S层，并将其从硅基底上剥离。使用Harris打孔器在P-D-M-S块的储液区打两个直径约一毫米的孔，以将固定通道和隔离通道的入口连接至气体管路，用于P-D-M-S膜的形变控制。将带有旋涂P-D-M-S层的硅片放置在塑料托盘上的图案一位置，P-D-M-S涂层面向上。

将带有图案二的打孔P-D-M-S块放置在托盘上，使模制面朝上。将塑料托盘放入等离子清洗仪内，施加低真空，用18瓦的空气等离子处理两个P-D-M-S表面，持续两分钟。取出经等离子处理的两个块体，轻轻按压图案一和图案二的等离子处理面，使其紧密贴合在一起。

将键合好的图案置于热对流烘箱中，在 50 摄氏度下烘烤两小时。从烘箱中取出键合好的器件后，使用硅片将带有图案一和图案二的部分切割下来，并使用哈里斯打孔器在流体层的进样口和出样口储液池处打孔。将键合好的 P-D-M-S 块体放置在塑料托盘上，流体层朝上，并在同一托盘上放置一块干净的盖玻片。

将盖玻片上的块体暴露于18瓦的空气等离子体中处理两分钟。调节真空压力，直至观察到紫色的腔室。将经过等离子体处理的P-D-M-S块体置于盖玻片上，并将键合后的结构放入烘箱中，在50摄氏度下烘烤两小时。

将设备存放在洁净的容器中，以备后续实验使用。取出设备，置于体视显微镜下，并连接管路。将一根微柔管一端连接至压缩氮气源，另一端连接三通接头。

将三通连接器的管路一和管路二分别连接至隔离膜中的捕集装置。将两根微柔性管连接至三通旋塞阀的两个出口端口。将这两根管的另一端连接至一根长度为八毫米、规格为18号的针头。

使用微量移液器通过入口端向流体层中加入M-9缓冲液。通过与针头相连的一端向两根管中加入去离子水。将两根针头插入打孔处，连接隔离膜和捕获膜。

打开氮气钢瓶的减压阀至14 psi，转动三通阀从第一根管路通气，使水通过控制层中的微流控通道（即捕获和隔离膜）进入装置。当通道充满水并完成预灌注后，通过三通旋塞释放压力。通过流动通道持续通入额外培养基以去除气泡。

该图展示了秀丽隐杆线虫 P-S-3-2-3-9 品系在微流控芯片内生长并每隔 8 至 10 小时被固定以获取荧光图像的结果。表达模式的变化代表了时间依赖性基因调控的一个实例，即同一基因在发育的不同阶段于不同细胞中表达。对秀丽隐杆线虫 W-D-I-S-5-1 基因型个体的成像显示，在 L-2、晚期 L-2、L-3 和 L-4 发育阶段，每个 P-V-D 神经元均呈现出类似烛台的分支状树突结构，分别包含初级、次级、三级和四级分支过程。

本图比较了在P-V-D培养基、设备培养的动物以及在N-G-M平板上培养的动物的发育情况。在线虫发育的不同阶段，S-P和Q-P的数量随年龄增长而增加。秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）经一滴3毫摩尔的左旋咪唑处理，以引起足够的麻痹，满足高分辨率成像的要求。

当使用N-G-M平板培养并在含3毫摩尔左旋咪唑的琼脂载玻片上成像时，来自相似发育阶段动物的S-P值无显著差异。此外，两个P-V-C细胞体之间的距离——其中一个位于尾部，另一个靠近阴门——随着在装置内培养和在N-G-M平板上培养的动物发育而逐渐增大。该图展示了在微流控装置内生长的动物中触觉感受神经元的高分辨率图像。

该图像序列展示了 P-L-M-R 神经元突起在不同时间点的完整动态过程，其中突出显示了线粒体和神经元突起。图中曲线表示神经元突起总长度随时间的变化，其增长斜率为每小时 10.4 微米。该微加工装置利用一层薄的 P-D-M-S 膜，在高压氮气作用下发生形变，从而将秀丽线虫（C-elegans）固定在原位，以实现高分辨率成像。

该方法可实现对秀丽隐杆线虫（C. elegans）细胞及亚细胞过程的长期纵向研究，适用于需要在较长时间内进行间歇性观察的实验。