用于纵向成像的微流控平台 秀丽隐杆线虫

本实验的总体目标是在受控环境条件下，对成年线虫进行长期成像，以追踪其行为反应及基因表达动力学。该方法有助于解答关于动物如何适应环境变化的关键科学问题，包括核心行为、基因表达、记忆与学习等方面的差异。该技术能够在动态调控的环境中对单个动物进行多路长期观察，同时以高分辨率同步检测适应过程中的多个方面。

该技术的应用有助于对动物适应性进行定量研究，因为获取高精度的动力学数据可以促进数学建模以及复杂假设的提出与验证。在进行实验前，首先将出口端的注射器针头连接至一段50厘米长的注射器导管。制作适配针时，使用镊子将20号、½英寸长的针头从针座上拔出针杆，并用本生灯去除残留的塑料。

用镊子夹住针头的两端，根据实验装置的几何形状弯曲适配针，然后将针头插入出口端注射器管的另一端约一半深度。接下来，将一个缓冲液入口注射器的尖端直接连接到三通阀上，并将缓冲液入口注射器连接到一段一米长的注射器管。将适配针插入管子的开口端约一半深度，通过注射器尖端将缓冲液交换注射器连接到一段50厘米长的注射器管。

将注射器管连接到三通阀的剩余端口并关闭阀门。使用接头针头，将蠕虫进样注射器连接到一段一米长的注射器管上，操作方法如前所述。然后用S培养基将所有材料冲洗两次，并用新鲜的S培养基充满已冲洗的注射器和管路，注意去除所有气泡。

现在，将出口注射器管路连接至设备出口，并将出口注射器管路末端的适配针插入出口端口。通过出口注入少量 S 培养基，使装置内部充满液体，直至缓冲液入口和线虫入口均有 S 培养基流出。将缓冲液入口注射器管路连接至设备的缓冲液入口端口，并使用直径为 1/32 英寸的不锈钢圆销堵住线虫入口。

将微流控装置安装在带有电动载物台的倒置荧光显微镜上，并将注射泵用胶带固定在显微镜附近的摇床边缘，以确保摇动时泵不会晃动。然后，将缓冲液入口端的注射器装入注射泵，并设置泵以每分钟3 µL的流速向装置持续输送S培养基。为了将细菌加载到微流控装置中，首先使用一支新的注射器吸取高浓度的E.coli OP50菌悬液。

将注射器垂直放置，轻弹针筒数次，使所有气泡聚集到注射器顶部。关闭摇床，并关闭缓冲液入口注射器的三通阀。将缓冲液入口注射器更换为含有细菌的注射器，推动活塞排出顶部聚集的全部空气，直至少量细菌悬液进入缓冲液置换系统，且OP50菌液注射器或阀门中无残留气泡为止。

关闭阀门后，将含有细菌的注射器连接至注射泵，并开启轨道摇床。设定摇床转速约为 200 RPM，流速为 100 微升每分钟。当 OP50 缓冲液在装置内完全扩散后，将流速调回至 3 微升每分钟。

为了将线虫加载到装置中，首先用100微升新鲜的OP50菌液填充一个650微升的低吸附微型离心管，并使用线虫挑取工具从线虫生长培养基琼脂平板上逐个转移20至30条年龄同步化的年轻成虫至该管中。用新鲜的OP50菌液填充线虫进样注射器及注射器管，然后将约500微升菌液注入微型离心管中。接着，将含有线虫的菌液吸入线虫进样注射器管中，并将线虫进样注射器连接至装置的线虫进样口。

将所有线虫通过蠕虫入口注射器管注入微流控装置，然后断开蠕虫入口注射器和注射器管。用插针封闭蠕虫入口，并将缓冲液入口注射器从机械泵上卸下。使用缓冲液入口注射器手动将蠕虫推入通道中，并在需要时使用出口注射器逆转蠕虫的移动方向。

装载动物需要一定的协调操作。使用注射器推杆轻轻推动，使线虫与通道对齐，然后稍加力度推动，将线虫完全推入通道内。随后，让线虫在新环境中适应两到三个小时，再开始实验。

线虫被限制在通道内，但并未被固定。大多数线虫在整个实验过程中会停留在其通道中，但部分线虫可能会逃逸或卡在微裂隙中。此处可观察到在装置中一只代表性线虫在十小时内的明场图像。

利用在免疫反应基因一启动子驱动下表达GFP的转基因线虫，当感染铜绿假单胞菌PA14后，在接触病原体的最初五小时内，可在线虫的中段和尾部观察到GFP表达，并在随后的五小时内逐渐增强为强烈的全身体表达。将每条线虫的总荧光强度随感染后时间的变化绘制成图，可展示免疫反应基因一诱导的动力学过程，以及不同线虫在诱导时间和诱导程度上的个体差异。对每条线虫在各时间点产下的卵进行延时成像，可绘制每条线虫感染后随时间累积产卵数量的变化曲线，从而捕捉个体间的变异情况，以及随着感染进展由病原体引起的产卵行为下降现象。

一旦掌握，可在一小时内完成微流控装置的制备和加载。装置加载并使线虫适应后，可向线虫递送其他试剂，例如特定药物或感兴趣的化学信号分子，以进一步探究线虫神经和遗传系统的调控机制。该技术开发后，我们及合作者已将其用于解析线虫在多种环境条件下的摄食行为，以及其遗传系统对热激、感染和饥饿的响应。

观看本视频后，您应能充分理解如何使用微流控装置进行纵向实验。