大规模自上而下蛋白质组学采用毛细管区带电泳串联质谱法

该方法有助于提高对细胞中蛋白质异构体及蛋白质翻译后修饰的大规模、高分辨率表征能力。该技术的主要优势在于，毛细管区带电泳质谱法可实现对完整蛋白质的高效分离和高灵敏度检测。进行毛细管预处理时，需在10 psi压力下用氮气干燥至少12小时。

然后，使用注射泵将体积分数为50%的甲基丙烯酸丙酯甲醇溶液注入毛细管中。用硅橡胶密封毛细管的两端。在室温下孵育至少24小时后，按照文本方案中的描述，继续在分离毛细管内壁涂覆线性聚丙烯酰胺。

使用温和的火焰灼烧毛细管的一端，去除距其一端约四厘米处的聚酰胺外层涂层。轻轻擦拭灼烧过的部位，彻底清除残留的聚酰胺涂层。在200微升离心管的管底钻一个与毛细管外径大小相近的小孔，以便将毛细管穿过该孔后能够稳固固定。

将毛细管靠近烧灼端的一端穿过孔洞，直至烧灼部分进入管内。然后，向200微升的管中加入约150微升的HF，使HF溶液在毛细管的烧灼部分上升至约一半位置。将毛细管在室温下于HF溶液中孵育90至100分钟。

按照文本方案中的描述制备标准蛋白质混合物和大肠杆菌样品。为建立毛细管区带电泳（CZE）系统，将样品、背景电解质和分离毛细管装入CZE自动进样器中。在CZE自动进样器的手动控制页面中选择样品加载。

将背景电解质小瓶装入自动进样器的缓冲液托盘中，并记录其在缓冲液托盘中的位置。然后，将样品小瓶装入自动进样器的样品托盘中，并记录其在样品托盘中的位置。使用手动控制将自动进样器移至对齐位置。

现在，使用毛细管未刻蚀的一端，将分离毛细管装入CZE自动进样器中。如果样品体积低于50 µL，请调整毛细管进样端的高度。通过手动控制将自动进样器切换至待机状态。

在系统中输入样品位置，并将毛细管移至样品处。将毛细管的进样端进一步下推，直至触及样品瓶底部。继续使用手动控制，以 20 psi 的压力用背景电解质冲洗毛细管 20 分钟。

现在，将商用的电驱动泵鞘流接口安装至质谱仪前端。用含有10%（体积分数）甲醇和0.2%（体积分数）甲酸的LCMS级水溶液缓冲液填充鞘流缓冲液储液罐。通过注射器手动加压，用鞘流缓冲液冲洗接口中的T形接头。

将外径为1毫米的电喷雾发射器末端穿过套管，并通过接头将发射器与T型接口的一个端口连接。再次使用注射器手动冲洗T型接口，以使鞘液缓冲液充满发射器。借助接口附带的摄像头，调节发射器喷口与质谱仪入口之间的距离至约2毫米。

在鞘液缓冲液瓶上施加 2 至 2.2 千伏的电压以产生电喷雾。然后调节喷雾电压，以获得稳定的电喷雾。在此过程中，对毛细管的进样端施加低压，确保毛细管内无气泡。

关闭喷雾电压，轻轻将分离毛细管的刻蚀端经T形接头穿入喷雾头，直至无法继续推进。停止毛细管进样端的低压后，用鞘液缓冲液轻微冲洗喷雾头。再次施加2至2.2千伏的喷雾电压以测试喷雾情况。

在主仪器界面的文件下拉菜单中选择新方法。随后，为样品进样设置如下参数：进样起始样品瓶和结束样品瓶均选为进样口，样品盘位置设为样品，压力设为 5 psi，千伏设为 0，持续时间为 95 秒。然后，设置分离标准蛋白质混合样品的参数：进样口设为进样瓶，样品盘位置设为缓冲液，压力设为 0 psi，千伏设为 30，持续时间为 4,200 秒。

为分离大肠杆菌蛋白质组样品，设置进样口为进样瓶，托盘为缓冲液，压力为0 psi，电压为20 kV，持续时间为6,600秒。最后，设置进样口为进样瓶，托盘为缓冲液，压力为10 psi，电压为30 kV，持续时间为600秒，用于毛细管冲洗。现在，使用四极离子阱质谱仪设置完整蛋白质分析的MS和MS/MS参数。

为调整调谐文件设置，请开启完整蛋白质模式，并将捕获压力设为 0.2。将离子传输毛细管温度设置为 320 摄氏度，S-透镜射频水平设为 55。要执行 CZE MS/MS 实验，首先在质谱仪计算机上选择运行序列，然后启动数据采集方法。

然后，在毛细管电泳自动进样器的计算机上启动毛细管电泳程序。使用 TopPIC 套件中的 TopPIC 软件及其图形用户界面进行数据库搜索。单击数据库文件，并选择合适的数据库用于搜索。

单击质谱文件并选择生成的 ms2.msalign 文件作为输入。选择 MS1 特征文件，并选取生成的特征文件。

由于碘乙酰胺处理，将半胱氨酸的羧甲基化（C57）设为固定修饰。选择诱饵数据库功能，在截断值设置中，于谱图水平旁边的下拉菜单中选择错误发现率。将谱图水平的错误发现率设为0.01。

保持生成函数未选中状态，并将误差容差设置为百万分之十五。在蛋白质形式水平上，将错误发现率设置为 0.05。在高级参数中，从下拉菜单中选择最大质量偏移数为二。

将未知修饰的最大质量偏移设置为 500 道尔顿。其余参数均保持默认值，点击图形用户界面右下角的开始按钮。标准蛋白质混合物的代表性电泳图谱如下所示。

标准蛋白质混合物通常至少重复运行两次，以评估系统的分离效率和重现性。分离效率可通过某些蛋白质的理论塔板数来评估。重现性可通过蛋白质信号强度和迁移时间的相对标准偏差来评估。

CZE MS/MS 平台可用于对各种复杂蛋白质组中的蛋白质变体进行大规模表征，在单次运行中以高置信度鉴定出超过 500 种蛋白质变体和 190 种蛋白质。此处，电泳图的放大视图可用于评估系统的分离窗口。极低的 E 值和谱图 FDR 表明蛋白质变体鉴定具有高置信度。匹配的碎片离子数量较多，进一步说明鉴定结果具有高可信度。在进行该操作时，务必记住要缓慢而轻柔地将刻蚀分离毛细管穿入电喷雾发射器中。

可在CZE-MS流程中采用稳定同位素标记或无标记方法，以确定不同条件下细胞中蛋白质异构体丰度的变化。该技术发展后，为自上而下蛋白质组学领域的研究人员探索蛋白质异构体在调控细胞多种生物学过程中的作用铺平了道路。请注意，使用氢氟酸具有极高的危险性，进行该操作时必须采取适当防护措施，例如穿戴合适的个人防护装备，并制定应急处理预案。