通过逐步噬菌体筛选组合式单域抗体文库创建高特异性化学诱导蛋白二聚化系统

本方案具有重要意义，因为它提供了一种通用方法，可用于构建以蛋白质二聚化系统为基础的生物传感器，以检测多种小分子。此外，该方法利用一个高度多样化的蛋白质文库，能够以高效且经济的方式筛选针对不同配体的生物传感器，且无需使用专用设备。所构建的生物传感器可用于化学调控细胞行为，并实时监测细胞代谢物的变化。

通过本视频演示，研究人员可以观察到这些技术的详细操作步骤，并对实验结果有明确的预期。每轮筛选开始时，将单个TG1电转感受态细胞菌落接种于6毫升2YT培养基中，在37摄氏度、250转/分钟条件下培养至600纳米波长下的吸光度约为0.5。当达到最佳光密度时，将细胞置于冰上。

为制备阴性筛选磁珠，将300微升包被链霉亲和素的磁珠置于磁性分离架上，每次用1毫升含0.5% Tween的PBS缓冲液洗涤三次，再每次用1毫升PBS洗涤两次。用1毫升含1%酪蛋白的PBS重悬磁珠，并加入磁珠标称结合能力五倍量的生物素对磁珠进行饱和处理。室温旋转孵育1小时后，按上述方法用含Tween的PBS洗涤五次，再用PBS洗涤三次。

最后一次洗涤后，将约1×10¹³个噬菌体颗粒加入含1% 脱脂奶粉和1% 牛血清白蛋白的PBS中，与磁珠混合，室温下旋转孵育1小时。孵育结束后，将上清液转移至1.5毫升离心管中。进行生物素化配体结合的链霉亲和素磁珠正向筛选时，根据说明书计算全结合容量，选用负筛所用磁珠体积的一半，用目标生物素化配体以五倍全结合容量进行饱和处理。

室温旋转孵育一小时后，用含Tween的PBS洗涤磁珠五次，再单独用PBS洗涤三次，如图所示。随后加入1毫升含1%酪蛋白和1%牛血清白蛋白的溶液，旋转孵育一小时以封闭磁珠。孵育结束后，将链霉亲和素包被的磁珠用含Tween的PBS洗涤三次，再单独用PBS洗涤一次，如图所示，并用未结合的噬菌体重新悬浮链霉亲和素包被的磁珠。小心吸取上清液（含未结合的噬菌体），避免扰动磁珠，将该样品保留备用，作为输入样本。

然后按照所示方法，用含 Tween 的 PBS 洗涤珠子 10 次，再用 PBS 洗涤 5 次，每洗涤三次后将珠子转移至新管中，以避免结合的噬菌体非特异性地吸附到管壁上。为竞争性洗脱结合的噬菌体，向阳性筛选珠子中加入 450 微升微摩尔浓度的非生物素化配体，并将珠子置于旋转仪上孵育 30 分钟。孵育结束后，将上清液转移至新管中，作为输出样品使用。

对于输入滴定，用PBS将输入噬菌体进行10倍系列稀释，最高稀释至1×10⁹倍。从1×10⁷至1×10⁹的稀释液中分别取10 µL，加入到已准备好的70 µL TG1细胞等分试样中。在37°C孵育45分钟后，将感染的TG1细胞分别涂布于含有100 µg/mL氨苄青霉素和2%葡萄糖的90 mm 2YT琼脂平板上，于37°C过夜培养。

第二天早晨，使用公式计算噬菌体的输入量。对于输出感染和滴定，将洗脱的噬菌体加入3毫升TG1细胞中，在37摄氏度水浴中孵育45分钟。然后用新鲜的2YT培养基对感染后的细胞进行10倍系列稀释，直至稀释到1×10³浓度，并将每种稀释液涂布于90毫米的2YT琼脂平板上，在37摄氏度下过夜培养。

第二天早晨，根据公式计算噬菌体产量。为了从富集的亚文库中分离单个克隆，将过夜培养的、感染噬菌体的TG1细胞平板上的单菌落转移至无菌深孔板中，每孔加入含氨苄青霉素的250微升2YT培养基，于37摄氏度过夜培养。当细胞在600纳米处的光密度达到约0.5时，向每孔加入5 × 10⁹ pfu/mL的CM13辅助噬菌体，于37摄氏度、250转/分钟条件下孵育45分钟。

孵育结束后，向每孔中加入500微升添加了氨苄青霉素和50微克/毫升卡那霉素的2YT培养基，将培养板置于25摄氏度、250转/分钟条件下过夜培养。次日早晨，通过离心沉淀细胞，以收集噬菌体颗粒。为通过ELISA验证锚定结合，使用包被缓冲液中含5微克/毫升链霉亲和素的溶液，每孔加入100微升，于4摄氏度包被96孔ELISA板过夜。

第二天早晨，用 300 微升 PBS 加 Tween 洗涤平板三次，然后向靶标孔中加入 100 微升 1 微摩尔的生物素标记靶标，向相应的对照孔中加入 100 微升 1 微摩尔的生物素或靶标同源物。室温孵育 1 小时后，每次用 PBS 加 Tween 洗涤 5 次，每次洗涤后每孔加入 300 微升 1% 乳酪素，室温下封闭非特异性结合 1 小时。孵育结束后，每次用新鲜的 PBS 加 Tween 洗涤 3 次，然后加入纯化的噬菌体上清液。

室温孵育一小时后，用新鲜的含吐温PBS溶液洗涤平板10次，每次更换PBS。每孔加入100 µL辣根过氧化物酶标记的M13主要外壳蛋白抗体，室温孵育一小时。然后按所示方法洗涤平板三次，每孔加入100 µL TMB底物溶液，室温孵育10分钟，或直至观察到明显的颜色变化。

然后每孔加入100微升1摩尔的盐酸终止反应，并在分光光度计上于450纳米处读取吸光值。在完成锚定结合剂验证后，还应使用相同的蛋白质文库对锚定结合剂-配体复合物进行二聚化结合剂筛选。经过四到六轮筛选后典型的富集结果可很好地表明亚文库中潜在阳性克隆的比例较高，此时可能无需进行更多轮次的筛选。

单克隆ELISA适用于分析锚定结合物和二聚化结合物的相对结合亲和力与选择性，并有助于比较不同克隆之间的结合选择性。同样，二聚化结合物筛选能够鉴定出仅在有或无配体存在时与固定的锚定结合物形成异源二聚体的克隆。这些依赖于配体浓度的结合数据表明，与对照样本表现出的弱结合相比，所测试的纳米抗体更适合用于构建化学诱导二聚化系统。

此外，可采用分析型尺寸排阻色谱法，在配体存在的情况下确认锚定蛋白与二聚化结合物之间形成的异源二聚体。例如，在本实验中，当锚定蛋白、二聚化结合物与大麻二酚共同混合时，观察到一个二聚体峰；相比之下，在缺乏大麻二酚的情况下，或当各个结合物单独上柱时，均未检测到二聚体峰。

应将蛋白质二聚化系统在酵母或哺乳动物细胞中进行基因编码，以进一步验证所选生物传感器在体内应用中的可行性。我们期望该方法能够为其他研究人员提供有效且必要的工具，用于在活体环境中以高时空分辨率检测重要的代谢物、信号分子或药物。