膜蛋白间去垢剂敏感性相互作用的检测

本实验的总体目标是检测膜蛋白或其他蛋白质之间对去垢剂敏感的相互作用。该实验要求一种蛋白带有组氨酸标签并在细胞中过表达，而另一种为带有myc标签的肽段。该方法有助于回答生物化学领域中关于重要蛋白质相互作用研究的相关问题。

该技术的主要优势在于能够以去垢剂敏感的方式检测膜蛋白之间的相互作用。该操作步骤快速且简便。尽管该方法可为膜蛋白相互作用提供见解，也可用于研究弱蛋白相互作用。

我们最初想到这种方法，是由于希望检测膜蛋白Saltilin与GLUT4之间的相互作用，但多次尝试从哺乳动物裂解液中进行共免疫沉淀均未成功。要订购该肽段，请选择对相互作用至关重要的肽段目标序列，并在该序列的末端或C端添加一个myc表位。肽段到货后，用超纯水配制每毫升含100微克的肽段工作溶液。

在四个10厘米的培养皿中接种3T3-L1前脂肪细胞，并置于培养箱中培养。随后，将其中两个培养皿用带有6X组蛋白标签的目标蛋白质粒转染，并标记为HISP；另两个培养皿用两种对照质粒转染，并标记为WT。转染后，将细胞在培养箱中继续培养48小时，使其融合度达到80%至90%。为制备细胞裂解液，先将细胞置于冰上，用10毫升预冷至4摄氏度的1X磷酸盐缓冲液洗涤三次。

然后，向每个样品中加入 500 µL 裂解缓冲液。接着，使用细胞刮刀将细胞从培养皿上刮下，以制备裂解液。将每个培养皿中制备的细胞裂解液分别转移至四个独立的 1.5 mm 离心管中，并标记所有离心管。

然后，使用26号针头的注射器将细胞裂解液反复抽吸5次，以实现完全的细胞裂解。接着，在4°C条件下，以16000×g离心10分钟。将上清液转移至4个标记相同的新的离心管中。

为便于后续故障排查和对照实验，取 20 微升细胞裂解液分装，并于 -20 摄氏度保存。如需后续使用，用盐酸将洗涤缓冲液的 pH 值从 8 滴定至 6，并将缓冲液储存在 4 摄氏度。接下来，为制备均一的钴珠悬浮液，请轻轻旋转瓶子。

然后，将40微升钴珠悬浮液转移至所有分别标记的四个试管中。加入钴珠后，向各试管中加入1毫升裂解缓冲液。随后，以1000×g离心5秒。

弃去上清液，用移液器向沉淀的磁珠中加入40微升裂解缓冲液。然后，将细胞裂解物转移至相应的离心管中，在4摄氏度下使用管式旋转仪孵育90分钟。90分钟后，在1000×g离心5秒。

然后，收集标记为“Flowthrough-1”的上清液，并在20摄氏度下保存。接着，向各管中加入500微升pH8的洗涤缓冲液，轻轻重悬磁珠。以1000×g离心5秒，弃去上清液。

然后，根据标签向各管中加入 pH 8 的洗涤缓冲液（pH 8 或 6），充分重悬珠子。以 1000×g 离心 5 秒，弃去上清液。用 pH 6 或 8 的水缓冲液配制 1 微克/毫升的肽工作溶液。

然后，向已洗涤的微珠中加入100 µL肽溶液，微珠应与相应pH的溶液对应。接着，将微珠置于4°C下，在试管旋转仪上孵育30分钟。随后，取四个微柱，标记后放入已标记为“穿流-2”的收集管中。孵育结束后，将孵育混合物加入微柱中。

让溶液依靠重力作用流过，并收集流出液。将层析柱放入新的收集管中，于20摄氏度保存。随后，通过重力流将500微升pH为6或8的洗涤缓冲液分别加入各层析柱中，弃去流出液。

重复此步骤四次。以1000×g离心5秒。将柱置于新收集管中，收集管标记为洗脱。

必须非常小心且均匀地清洗所有试管中的珠子，以去除未结合的肽。向清洗后的珠子中加入 40 微升含 β-巯基乙醇的三羟甲基甘氨酸样品缓冲液，在室温下静置 20 分钟。

将离心柱在8000×g下离心两分钟。弃去离心柱，将收集管在100摄氏度下加热10分钟。然后，在1000×g下离心五秒钟。

或者，向洗涤后的磁珠中加入40 µL洗脱咪唑缓冲液，在室温下孵育20分钟。孵育结束后，以8000×g离心2分钟。弃去柱子，加入40 µL三羟甲基甘氨酸（tricine）上样缓冲液。

将收集管在 100 摄氏度加热 10 分钟，然后在 1000×g 离心 5 秒。使用市售的 10–20% tricine 梯度凝胶。使用 Tris/Tricine/SDS 电泳缓冲液，每孔上样 20 µL 洗脱样品和总裂解液，然后启动电泳装置进行电泳。

电泳结束后，使用含有20%甲醇的转移缓冲液将凝胶中的物质转移到0.45微米的硝酸纤维素膜上。封闭膜后，将其水平切开。接着，用Anti-His P抗体孵育膜的上半部分，用anti-myc抗体孵育膜的下半部分。

为了研究固定在钴珠上的Sortilin与GLUT4之间的相互作用，进行了免疫印迹分析。收集野生型和转染了Sortilin-myc/His标签的3T3-L1细胞的细胞裂解液和洗脱液，随后上样至SDS-PAGE凝胶。使用抗myc抗体对印迹膜进行杂交检测。

该印迹显示了转染上清液中110千道尔顿的Sortilin-myc/His标签蛋白以及5千道尔顿的myc标记腔内第一环GLUT4。接下来，为了研究pH值的重要性以及固定在钴珠上的Sortilin与GLUT4之间的相互作用，进行了免疫印迹分析。在该实验中，将myc标记腔内第一环GLUT4分别在pH 6和pH 8条件下与固定了Sortilin-myc/His标签蛋白的珠子共同孵育。

该印迹结果显示，在 pH6 和 pH8 条件下，从表达 Sortilin-myc/His 标签的转染 3T3-L1 细胞所获得的洗脱液中，Sortilin-myc/His 与 myc 标记的 GLUT4 腔内第一环之间均存在明显的相互作用。一旦掌握该技术，从开始到样品准备好进行 Western 印迹分析可在三至四小时内完成。在进行该实验操作时，需注意设计出可溶性的肽段，最好能溶于水。

为了加强您的实验结果，可以进行其他方法，例如交联后的免疫共沉淀。观看本视频后，您应能够充分理解如何在对去垢剂敏感的实验步骤中检测膜蛋白及蛋白质相互作用。该方法还可用于探索蛋白质片段之间的相互作用。

轻柔的节奏爵士乐。