小角中子散射实验中用于膜蛋白结构分析的对比度匹配去垢剂 从头算 建模

该方法有助于解答有关整合膜蛋白的关键问题，例如其寡聚状态、大小、整体形状以及在溶液中的低分辨率结构。对膜蛋白进行溶液研究需要使用去垢剂等稳定分子。该技术的优势在于可使去垢剂在检测中“隐形”，从而突出膜蛋白本身的信号。

该技术的影响延伸至众多生物学和医学研究问题，因为超过三分之一的蛋白质位于细胞膜中，在其中执行多种重要的细胞功能。对该方法进行可视化演示至关重要，因为氘标记和中子散射步骤较难掌握，目前仅有极少数机构提供这些技术的培训。首先，使用网络应用程序 MULCh（用于分析对比度变化数据的模块）确定中子散射长度密度（SLD）。

单击左侧导航窗格中的“contrast”以打开对比模块。输入项目标题的文本，并在下方分别输入两个组分的详细信息，作为亚基一和亚基二。在分子式文本框中输入每个组分的分子式。

然后在“体积”下方的输入框中输入每个组分的立方埃体积。最后，输入缓冲液组分的详细信息。点击提交以执行中子对比度计算。

生成一个结果页面，提供散射长度密度和对比度匹配点的表格，以及用于确定缓冲液中任意D2O百分比下这些参数的计算公式。请仔细审阅散射参数，特别关注各组分的对比度匹配点。在LB培养基中培养携带目标蛋白序列诱导型表达载体的大肠杆菌（E.coli）细胞，使其在600纳米处的光密度（OD 600）达到约1.0。

在扩增以过表达氘代蛋白之前，通过将LB培养物以1:20的比例稀释至3毫升最小培养基中，使大肠杆菌细胞适应氘代培养基。当培养物生长至OD 600约为1时，使用分别含有50%、75%和100%D2O的最小培养基重复进行1:20的稀释。适应后，继续在生物反应器中培养该菌液，以提高氘代细胞生物量的产量。

随着D2O含量的增加，细胞生长速率将下降。按照文本方案中所述步骤进行细胞收获、裂解和纯化。随后，使用快速蛋白液相色谱系统，以超过两个柱体积的终末交换缓冲液对尺寸排阻色谱柱进行平衡。

上样后，运行层析柱以分离出目标蛋白对应的组分。保留一份与缓冲液匹配的等分试样，用于小角中子散射（SANS）背景扣除。为采集SANS数据，首先将样品和缓冲液装入石英比色皿中。

确认光束快门已关闭后，进入样品环境区域，将石英池放入样品架中。记录每个样品池在样品架中的位置。离开样品环境区域前，检查该区域，确保光路无任何遮挡物。

然后打开束流快门，执行表格扫描以进行自动数据采集。遵循中子散射科学家提供的仪器操作说明。

使用 Mantid Plot 软件和 Python 脚本将小角中子散射（SANS）数据从二维图像约化为一维图谱。具体操作步骤为：登录远程分析集群，并在命令行中启动 Mantid Plot。随后打开提供的用户约化脚本，将样品及其对应缓冲液的扫描编号或标识符填入适当的列表中。

运行脚本以在指定位置生成包含四列数据的文本文件。右键单击相应的工作区和Mantid图，选择带误差的绘图方式，初步检查散射曲线。下载ATSAS软件包，并使用PRIMUS进行数据绘图、缓冲液缩放与扣除以及Guinier分析。

启动 ATSAS SAS 数据分析程序，加载与样品和缓冲液配对对应的已减除数据文件。为正确缩放缓冲液曲线，在高 Q 区域选择两条曲线均呈平坦且相似的数据范围，然后点击“操作”选项卡下方的缩放按钮。扩大数据范围以查看所有数据点，点击“相减”执行该操作。

使用SAS数据分析应用程序的分析选项卡，对扣除缓冲液后的样品数据进行Guinier分析。确保在列表中已选择正确的文件，然后点击回转半径。点击自动RG按钮，系统将自动尝试进行Guinier拟合。

扩展所用数据范围以包含所有低Q值数据，然后通过逐步去除高Q值数据点来缩小数据范围，直至Q max与RG的乘积小于1.3。利用残差图验证拟合范围内数据的线性性。对拟合区域进行微调，并监测这些参数值对拟合所用数据范围的敏感性。

在 gnome 中获取 R 的概率分布函数 P。现在，在分析选项卡中启动距离分布向导。获得与数据的良好拟合对于得到高质量的模型至关重要。

确定分子内的最大原子间距离 Dmax。通过取消勾选强制 Rmax 等于零的选项，并输入一个较大的 Dmax 值来估算 Dmax。P(R) 图中第一个与横轴的交点即给出该估计值。

逐步调整该 Dmax 值，以及用于优化对数据进行拟合的“gnome”拟合点数的数据范围，从而得到 R 的 P 曲线。在 SAS 数据分析的分析选项卡中，单击 dammif 按钮启动 PRIMUS 形状向导，并手动选择参数。根据拟合结果定义吉尼尔（Guinier）范围，然后使用导航按钮进入下一步。

根据R比值图定义拟合值，并进入下一步。为从头建模过程提供参数，然后通过点击提交按钮启动该过程。

使用 ATSAS 中的 supcomb 工具，将最终的无包膜结构与相关的高分辨率模型进行叠加和叠加拟合。将待拟合到 SANS 包膜的高分辨率 PDB 模型副本放置于工作目录中。然后从命令行执行 supcomb，将 PDB 文件名作为两个参数输入，其中模板结构列在首位。

最后使用 PyMOL（一种三维分子图形可视化程序）来展示从头建模的结果。将 SANS 包络与高分辨率结构叠加后，即可通过任何分子图形可视化程序查看这些模型。文中展示了 PyMOL 可视化过程的概览。

在 PyMOL 中打开 PDB 结构文件后，模型应显示在 PyMOL 查看窗口中。可使用每个文件名旁的 S 按钮来更改各个模型的表示方式。此处对 SANS 包络采用表面表示，对高分辨率模型的蛋白质骨架采用卡通表示。

可在 C 按钮下的可用选项中选择合适的配色方案。对于蛋白质链，使用彩虹色（chainbow）着色可提供从 N 末端到 C 末端的色彩梯度，有助于结构解读。对表面表示应用透明度，以便更清晰地观察包膜内的蛋白质结构。

对于出版用图像，建议使用白色背景。应用这些可视化提示后，可通过点击并拖动结构来查看3D结构。可对视角以及分子的旋转和平移进行操作。

在进行该实验操作时，重要的是要准确匹配去垢剂头部和尾部基团与D2O H2O溶剂的中子对比度。该技术建立后，为研究膜内天冬氨酸蛋白酶的结构开辟了道路。这类蛋白质参与免疫反应、丙型肝炎以及阿尔茨海默病。

请务必注意，在生物化学实验室和中子束设施中工作可能存在危险。执行本实验步骤时，必须采取预防措施，例如佩戴个人防护装备，并严格遵守所有设施的安全规定和放射性警示要求。