一种快速银染方案，可利用非变性聚丙烯酰胺凝胶简单高效地检测SSR标记

本实验方案的总体目标是介绍一种优化的银染方法，用于在非变性聚丙烯酰胺凝胶中快速、简便且低成本地检测SSR标记。SSR标记的快速基因分型有助于回答遗传学研究与应用领域的关键问题，例如遗传多样性分析以及分子育种项目中的标记辅助选择。该技术的主要优势在于操作简便、耗时较短，并且相比其他SSR标记检测方案，所需化学试剂更少。

该方法避免了传统方案中的固定、终止反应以及多次洗涤步骤，仅需浸润和显色两个主要步骤。采用本方案可获得清晰的图像，且无背景干扰，能够明确检测SSR条带模式。

利用该技术，每天可筛选约 800 个 DNA 样本，该方法已成功应用于烟草和开花小白菜的研究。根据文本方案制备 PCR 产物和凝胶溶液后，使用自来水中的洗涤剂清洗一套玻璃板和垫片，随后用蒸馏水彻底冲洗。将玻璃板置于板架上自然晾干。

将1毫升Bind-silane溶液均匀涂布于矩形玻璃片的内表面，干燥5分钟。然后用棉签将1毫升Repel-silane溶液均匀涂布于带缺口玻璃片的内表面，并用纸巾擦去多余溶液，随后静置晾干5分钟。将玻璃片与间隔片组装，将带缺口的玻璃片置于上方。

使用制胶夹将组装好的玻璃板两侧夹紧。接着，将适量的6%非变性聚丙烯酰胺凝胶溶液倒入烧杯中用于制胶板。加入20 µL TEMED和200 µL新鲜的20% APS，轻轻混匀。

立即小心地将溶液沿凹口玻璃板的边缘倒入已组装好的玻璃板中，加液至接近顶部。然后插入梳子。接着在梳子上方加入少量凝胶溶液，室温静置 30 分钟，使凝胶完全凝固。

当凝胶完全聚合后，取下制胶夹具，将玻璃板组件放入电泳槽装置中，使带缺口的玻璃板朝向电泳槽上层缓冲液室。使用大型夹具将玻璃板组件固定在电泳槽装置上。向上层和下层电泳槽室各加入1升0.5 × TBE缓冲液。

然后移除梳子，使用装有缓冲液的移液器或注射器彻底冲洗所有加样孔。进行聚丙烯酰胺凝胶电泳时，将约一微升的PCR产物加入每个加样孔中。同时，在两侧的加样孔中加入DNA Marker。

然后将安全盖固定到上层缓冲液室。将导线连接至电源，红色导线接红色接口，黑色导线接黑色接口。以110伏的恒定电压电泳，直至染料迁移至指定位置。

通常，电泳约 70 分钟。电泳结束后，打开阀门，将上层室中的缓冲液排入一个大烧杯中。取下两侧夹子，从装置上取下玻璃板。

然后使用刮刀小心地从一侧分离带缺口的玻璃板，并确保凝胶仍附着在另一侧涂有Bind-silane的玻璃板上。接着，通过将1.5克硝酸银溶解于1升蒸馏水中，配制一升新鲜的浸渍溶液。然后，通过将10克氢氧化钠溶解于900毫升蒸馏水中，配制一升新鲜的显影溶液。

加入一毫升37%甲醛，并用蒸馏水定容至一升。用大量蒸馏水小心冲洗凝胶和玻璃板，以去除电泳缓冲液。然后将凝胶面朝上的玻璃板放入塑料托盘中，并将凝胶完全浸入一升浸渍溶液中。

将托盘置于摇床中，以60 RPM的速度轻轻振荡三到四分钟。将平板从浸渍溶液中取出，放入另一个托盘中。然后用大量蒸馏水冲洗平板表面及凝胶，每次三到五秒，重复两次，以去除残留的浸渍溶液。

浸渍后的凝胶洗涤步骤至关重要。洗涤不充分可能导致浸渍溶液去除不完全，从而产生较深的背景。

将凝胶面向上的玻板放入另一个托盘中。将玻板浸入一升显影液中，然后以50转/分钟的速度轻轻摇动托盘约三分钟。观察DNA条带的出现情况，当DNA条带信号与背景噪音的比值达到最高时，停止显影。

合适的显色时间是另一个关键步骤。显色过度会导致背景呈深棕色，DNA片段图像对比度降低。用大量蒸馏水将平板和凝胶冲洗两次，并用纸巾将凝胶板擦干。

然后使用扫描仪和相应的软件以300 DPI分辨率扫描凝胶，并调整亮度和对比度，以清晰显示DNA条带。最后，根据图像中DNA片段的大小对SSR标记的条带模式进行判读。本实验中展示的PCR扩增产物是利用开花白菜和烟草中对应的SSR引物对扩增得到的。

电泳结束后，采用本视频展示的银染方法对聚丙烯酰胺凝胶进行染色，该方法能够明确检测到SSR标记的条带模式。为了比较不同银染方法的检测效率，将SSR标记的PCR产物通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分离后，分别使用五种已发表的银染方法以及本视频中展示的第六种方法进行显色观察。

本实验方案展现出最低的背景噪音和最高的DNA片段对比度，因而获得了最清晰的图像。在所测试的六种方案中，本方案耗时最短，且所需化学试剂种类和操作步骤最少。最后，本图展示了该方案的灵敏度，通过在非变性聚丙烯酰胺凝胶上对50至2000 bp的DNA标记物进行系列稀释测定，从第一泳道每条带10纳克，到第11泳道每条带9.8皮克DNA，均可清晰检测。

一旦掌握，若操作得当，该技术可在七分钟内完成。在进行此操作时，重要的是要记住防止浸润液和显影液之间的交叉污染。该技术发展成熟后，使研究人员能够快速进行SSR标记的基因分型。

观看本视频后，您应能够很好地掌握如何利用银染法在非变性聚丙烯酰胺凝胶中简单高效地检测SSR标记。请务必注意，操作化学试剂可能具有极高危险性，在进行本实验时应始终佩戴手套等防护用具。