负染电子显微镜方法的多种改进：应对复杂体系的工具

本视频的总体目标是展示几种不同的负染透射电子显微镜样品制备技术的变体。负染色法是快速评估电镜样品质量的最佳方法。需要认识到，不同的载网制备技术对某些样品的效果更佳。

对于任何特定样品，最有效的技术必须通过反复试验来确定。首先，使用碳膜法制备透射电镜载网，并按照随附的文字实验方案准备负染试剂。将覆有碳膜的透射电镜载网正面朝上放置在载玻片上。

将载网放入辉光放电仪中，在10毫安电流下处理至少30秒，以使载网具有亲水性。处理完成后，从放电仪中取出样品。然后使用一对负压镊子夹住载网边缘。

采用侧面染色法染色时，首先将三到五微升样品滴加至支撑面上。让样品在载网表面吸附10秒至1分钟，然后将载网边缘接触一张滤纸，利用毛细作用吸去液体。接着，在实验室用膜上放置50微升的超纯水或适当的挥发性缓冲液液滴。

轻轻将载网的碳膜表面接触液滴，使少量液滴吸附到载网表面。然后，将载网边缘接触一张滤纸，利用毛细作用将液体吸走。接着，在实验室用覆膜纸上放置两滴50 µL的染色试剂。

轻轻将载网的碳膜表面接触液滴，使少量液滴吸附到载网的上表面。如果染液扩散至载网背面，则表明碳膜已破损，必须弃用。10至15秒后，将载网边缘接触一张滤纸，利用毛细作用将液体吸走。

再重复此染色步骤一次，然后让载网自然晾干。若采用 flicking 法染色，需用负压镊子夹住载网边缘，将三至五微升样品滴加到支撑面上。一手持镊子，将载网倾斜至约 45 度角并朝向远离操作者的方向，快速甩动手腕，将附着在载网表面的大部分液滴甩去。

然后，使用玻璃巴斯德移液管向支撑表面滴加一滴洗涤液。甩去液滴，并重复数次以清洗样品。接着，向支撑表面滴加一滴染色试剂，再次甩去液滴。

根据观察样本所需的染色深度，重复此染色步骤一至三次。用滤纸的撕边轻轻接触载网边缘，去除多余的染液，然后让载网自然晾干。若采用快速冲洗法染色，首先将30至70微升染液吸入200微升移液器的吸头中。

旋转旋钮吸取5 µL空气，然后吸取5至30 µL洗涤试剂，接着再吸入一小段空气间隙，之后再吸取5 µL样品。用一对负压镊子夹住载网边缘，将载网倾斜约45度，使碳膜面向外侧。迅速地将移液枪尖中的全部液体沿碳膜表面一次性排出。

用滤纸的撕边接触载网边缘，吸去多余的染液，然后让载网自然晾干。负染色法中最合适的染色剂选择高度依赖于样品。最常用的染色剂是醋酸铀酰，但也可使用镧系元素染色剂。

对于深部包埋的样品，基于镧系元素的染色剂——乙酸铥和乙酸铒——所产生的负染效果在染色颗粒的明显对比度和清晰度方面与乙酸铀酰相当；其中，乙酸铥产生的图像比乙酸铒更清晰、更锐利。乙酸铥的晶粒较大，在高倍放大下尤为明显，如图中用1%乙酸铥染色的烟草花叶病毒纤维颗粒样品所示。使用乙酸铥时，烟草花叶病毒纤维颗粒的23埃重复结构肉眼即可清晰辨识。

其他测试的镧系染色剂均无法分辨此特征。另一种难以成像的样品是来源于肌肉的C蛋白。该样品根据染色方法的不同，会产生显著不同的图像。

采用侧向滴染法染色时，其呈现为球状、塌陷的翼形结构。当载网通过 flicking 法制备时，C 蛋白则表现为一系列类似串珠状的结构域，更能真实反映 C 蛋白的实际结构。

一旦掌握，制备负染样品仅需约一分钟。需要注意的是，每种样品对不同染色技术的反应各不相同。对于新样品，最佳方法必须通过实验确定。

请勿忘记，铀酰染色试剂具有毒性且具有轻微放射性。务必将其弃置于适当的废液处理系统中。