一种用于透射电子显微镜下获取微生物连续超薄切片的方法

本实验的主要目标是安全、简便地制备连续超薄切片。该方法有助于回答细胞生物学领域的关键问题，可在电子显微镜水平上提供完整细胞的定量及三维结构信息。该技术的主要优势在于，无需使用昂贵的设备即可完成连续超薄切片，且通过该方法可获得高分辨率图像。

开始此操作前，先清洁载玻片表面。然后将载玻片的一半浸入Formvar支撑膜制备装置上部柱中的1.5% Formvar溶液中，通过橡胶球向三通旋塞通入空气以压出溶液。打开三通旋塞并释放空气以降低压力，使溶液从柱中排出。

然后从装置中取出载玻片，在空气中晾干，使载玻片表面形成一层薄膜。用刀片刮去载玻片上薄膜的四个边缘。向载玻片哈气以促进薄膜与载玻片分离，随后将载玻片以较低的水平角度缓慢浸入水中，使薄膜脱离并漂浮于水面。

然后使用带孔的铝制支架从水中捞起Formvar膜。在体视显微镜下用超声修剪刀片和剃刀片修剪样品块之前，应先用光学显微镜观察样品块顶端，确认其表面存在细胞。接着将样品块安装到卡盘中，并将卡盘安装到修剪台上。

将包埋块修整至0.7 × 1.0毫米的尺寸。如果环氧树脂非常坚硬，可先使用超声修块刀修切方块，再用剃刀片进一步修整包埋块。切去一侧肩部以标记切面方向。

使用切片机上的金刚石刀修整样品块时，先将样品块夹头安装在超薄切片机的样品台上。用金刚石修块刀切割样品块表面。调整金刚石刀刃与样品块表面平行，并尽可能少地切去样品表面，以免丢失任何样品。

使用修块刀将刀台向左旋转30度，切割样本块的左侧边缘。该边缘将在连续切片中成为样本的上方。然后将刀台向右旋转30度，从标本左侧边缘约100微米处切割块面。

该边缘在连续切片中将成为样本的下侧。移除修块刀，将样本块顺时针旋转90度。将超薄切片刀安装至刀架上。

使用样品表面的较大区域，调整样品表面与刀刃，使其相互平行。接下来，在切片机的样品台及其支架上贴上胶带，并在边界处将胶带剪断。将样品台从切片机中取出，置于体视显微镜下。

用剃刀切下标本的大部分，保留用于连续切片的细小部分。使用巴斯德移液管将约一微升的0.5%氯丁橡胶溶液滴加到用于连续切片的标本侧面，使其具有黏性。然后将整个标本覆盖上氯丁橡胶溶液。立即用靠近标本的滤纸吸去多余的氯丁橡胶溶液。

接下来，准备三个用于捞取连续切片的狭缝载网。首先将载网的柄部弯曲至60度，用0.5%的Neoprene溶液处理载网，然后通过辉光放电使载网具有亲水性。

通过将带胶带的部分对齐，将样本块夹头放回切片机中的相同位置。这样可使样本面与刀刃彼此完全平行。然后将刀片移近样本。

用水填充刀舟后，用塑料盖覆盖切片机，以防止气流干扰。开始切片时，设定切片厚度为 200 纳米。切出第一片后，将切片厚度调整为 70 纳米。

当连续切片的数量达到20片时，将切片厚度设置为10纳米。由于切片机无法切割出10纳米厚的切片，因此不会出现新的切片，而已切下的切片会从刀刃上分离。接下来，将切片厚度设置为60纳米。

这将产生70纳米的切片，因为仪器会累加上一次设定的10纳米厚度。最后，将切片厚度重新设为70纳米，并继续切片，直至获得长度为1.8毫米的切片。为收集连续切片，首先将切片承载环放置在第三组切片区段上。

然后将水面提升环放置在刀架上。通过移动其杆部和手柄，将水面提升环（WSRL）的环置于连续切片的正上方。降低水面提升环的环，使其接触水面，从而将切片包围在环内。

通过将螺丝向下旋转，推动环圈下降，利用表面张力使水面升高。将切片移至环圈中心，置于水的最高点处，并使用一根毛发调整切片的方向。

用镊子辅助手持裸露的狭缝载网，轻轻接触切片组，并保持与水面平行，从而拾取切片。将带有切片的载网连同一小滴水一起放置到聚乙烯醇缩甲醛支持膜上。用滤纸吸去多余的水分。

待切片完全干燥后，撕去载网周围的聚乙烯醇薄膜，并取下带有切片的载网。将载网按正确顺序置于染色管的凹槽内，用醋酸铀和柠檬酸铅对切片进行染色。将五个载网按正确顺序放入多标本持载器中，使载网狭缝的长轴方向与标本持载器的轴线垂直。

使用网格固定器固定载网，并将样品台插入透射电子显微镜中。随后对目标细胞及所有细胞切片进行高倍成像。图中显示的是承载连续切片的五个载网的低倍视野图像。

一个载网上装载了18-25个切片。请注意，这些切片相互连接且厚度相同。此处展示的是围心室肌发生的连续切片。

该图展示了67个完整切片中的12个。发现该细胞具有一个大型拟核，由裸露的DNA纤维组成，带有单层拟核膜以及类似细菌的内共生体，但无线粒体。因此，该生物体似乎是一种从原核生物向真核生物演化的中间生命形式。

此处展示的是大肠杆菌的连续切片。该图显示了12个完整的切片。有趣的是，发现该细胞含有21,700个核糖体。

观看本视频后，您应该能够充分掌握如何制作连续超薄切片。一旦熟练掌握，若操作得当，该技术可在三小时内完成。