优化的负染色法：一种高通量电镜检测小分子及非对称蛋白结构的实验方案

本实验的总体目标是利用优化的高通量负染透射电镜技术，对小分子量且不对称的蛋白质进行成像。首先，在准备负染电镜工作站的同时，将蛋白质样品置于预先准备好的孵育装置中进行孵育。实验的第二步是将样品依次快速地在三个水滴中洗涤。

第三步是依次在三个染色液滴上对样品进行仔细染色。最后一步是从透射电镜载网的背面吸去多余的溶液，然后在氮气下轻轻干燥。最终，通过在低欠焦条件下进行透射电子显微镜成像，可以获得小分子蛋白质的高分辨率图像。

与冷冻电镜技术相比，该技术的主要优势在于能够实现高通量检测，并对小分子量且不对称的蛋白质结构进行高对比度成像，同时减少传统负染色法所导致的结构伪影。尽管该方法还可用于揭示小分子蛋白质机制（如胆固醇酯转移蛋白）的结构基础。

该方法也可应用于其他蛋白质，如IgG抗体、高密度脂蛋白和蛋白酶体，这些蛋白质的分子大小差异较大。由于洗涤和染色步骤在时间控制上存在差异，且样品转印过程中的轻微操作都可能对最终染色的蛋白质结果产生显著影响，因此对该方法进行可视化演示至关重要。本实验操作将由我实验室的Z.A.博士后研究员进行示范。在准备本实验方案时，必须格外注意配制1%尿素八溶液，并应尽量避免其暴露于光照条件下。

这包括在首次过滤溶液时，用铝箔包裹注射器 0.2 微米滤器的各个部件。过滤后，于实验当天将 2 毫升分装的样品用铝箔包裹后，于 -80 摄氏度保存。在室温水浴中解冻一份分装样品，待其完全解冻后使用。

用铝箔包裹部件，再次通过 0.02 微米滤器过滤。收集管也应用铝游戏副本包裹。将负染液转移至冰盒中，待使用时取出。

通过将一段8英寸长的param压在移液管吸头支撑架上，制备用于承载液滴的薄片。此操作可在表面形成直径为5毫米的凹痕，作为微孔。制作六排微孔后，将泡沫聚苯乙烯托盘表面的冰压平，然后将该薄片放置在冰上。

接下来，向左侧载网片的前三个孔中各加入 35 µL 去离子水。然后，向载网片右侧三个孔中各加入 35 µL 已配制好的负染液。盖上托盘以减少溶液的光照暴露。

这将用作染色工作台。现在，使用一个空的移液枪头盒并附加一个可固定镊子的装置，制备透射电镜（EM）载网孵育站。向盒中加入一半的冰，使镊子固定后其尖端接近冰面。

首先将覆有薄碳层的300目铜制透射电镜载网进行约10秒的辉光放电处理。接着，用镊子夹取载网并将其固定在透射电镜载网孵育装置上。将夹有载网的镊子悬挂，使载网倾斜45度，并位于冰面之上半英寸处。

现在将蛋白质样品用DPBS稀释至每毫升溶液含50至100微克蛋白质。立即取约4微升稀释后的样品加入电镜载网上。让样品孵育约1分钟。

一分钟后，迅速用滤纸轻拍网格，以去除多余的溶液。然后在染色站，将网格接触对位膜上的第一滴水。快速重复用滤纸干燥并用下一滴液体润湿的操作过程。

总共使用三个水滴，并尽快完成操作。清洗载网时必须迅速进行，以避免缓冲液变化对蛋白质产生不利影响。在最后一次水洗后三秒内用滤纸吸干，随即开始将载网漂浮在第一滴负染液上。

静置漂浮10秒。在此期间，将镊子尖端压入滤纸中数次以清洁。漂浮10秒后，用滤纸吸去溶液，然后在下一滴染液中再次漂浮2秒。

在这两秒内清洁镊子。接着，将载网吸干，然后将其放入第三个液滴中。此步骤期间，需完全覆盖染色站，持续一整分钟。

必须通过接触透射电镜载网的背面，保持精确的时间以去除染色液，确保载网均匀干燥。如果滤纸接触染色液时间过长，可能导致过多染色剂被去除，从而影响成像质量。接下来，继续进行载网的干燥步骤。

首先，将整个非碳面接触滤纸，直至溶液完全转移至滤纸上。其次，用温和的氮气流轻轻吹拂。然后将载网转移至铺有滤纸的培养皿中，并将培养皿部分覆盖。

将载网在室温下于培养皿中干燥30分钟。或者，含脂质的样品可在40摄氏度下烘烤1小时。完全干燥后，在开始操作前，先将透射电镜（TEM）调准，然后将电镜载网转移至电镜载网储存盒中。

通过负染网格上碳膜区域的功率谱，检查最高可见融霜环的分辨率，其分辨率应优于目标分辨率。然后，仔细调整对中，检查样品碳膜区域的功率谱。在正确对中条件下，应能观察到超过20个T tho环，对应于优于5埃的分辨率。

这些环是通过在1.6微米离焦和20.4电子/平方埃剂量条件下，将非晶碳图像进行傅里叶变换转移而制成的。现在将焦距调回至接近谢尔策聚焦条件，约为0.1微米，以便在观察电镜载网时对小分子蛋白质进行成像。理想情况下，在低倍镜下，染色区域通常位于较厚的、染色较深的云状区域边缘附近。

使用OPNS观察脂蛋白样本的结构。示例包括重组HDL、人血浆LDL、人血浆IDL和人血浆VLDL。还观察了较小的结构，如53千道尔顿的CETP。

这是通过电子显微镜成功成像的最小蛋白质之一。CETP晶体结构的叠加与图像吻合度非常高，显示出高度的动态性。此外，在160千道尔顿的免疫球蛋白G抗体中也观察到了异质性蛋白质。

三个亚基结构域清晰可见。通过使用IgG1抗体，将其与晶体结构进行比较。IgG1抗体的晶体结构在多个方面与这些抗体的电镜图像相吻合，例如结构域的位置及其形状。

其他观察到的分子包括28千道尔顿、无脂质的载脂蛋白A1（apo lipoprotein A one）grow EL以及蛋白酶体。本质上，OPNS方法显著拓展了电子显微镜对小型非对称结构成像的边界，并推动了相关机制研究。在操作过程中，应尽可能减少染色试剂的光照暴露，迅速洗涤样品，并在成像时使用近焦聚焦。

其他方法，如电子断层扫描，可用于回答更多问题，例如单个分子的纳米级分辨率结构及其间的构象变化。在此技术发展之后，为结构生物学领域的研究人员探索人类血浆脂蛋白间簇状酯转移的机制开辟了道路。