用于研究中枢神经元轴突曲张体形成与恢复的微生物力学系统

该加压流体装置的总体目标是在培养的神经元轴突上产生可重复且一致的肿胀。该方法有助于回答脑损伤领域中的关键问题，例如神经元损伤后亚细胞形态变化的机制。该技术的主要优势在于，其能够产生随时间可恢复的一致且可重复的形态学改变。

这是我们实验室开发的一项非常重要的技术。因为该系统不仅可以用于鉴定调控机械应力诱导轴突形态变化的分子机制——作为一种新型的神经元可塑性形式，还可作为筛选工具，用于发现治疗轻度或创伤性脑损伤的新药物和治疗策略。开始此操作时，将一盒或多盒12毫米或25毫米的盖玻片放入盛有70%硝酸的玻璃烧杯中，在室温下孵育过夜。

第二天，将所有盖玻片转移至一个装有2.5升双蒸水的四升烧杯中。以100 RPM的转速振荡含有盖玻片的烧杯一小时，并记得在振荡过程中使用橡皮筋固定烧杯。随后，将清洗后的盖玻片转移至带金属盖的干燥烧瓶中。

将盖玻片置于 225 摄氏度的烘箱中烘烤 6 小时。随后使其冷却至室温，并储存在灭菌的塑料容器中备用。现在，将一片盖玻片放入 24 孔板的每个孔中。

在12毫米的盖玻片上加入30微升盖玻片包被液并轻轻旋转混匀。随后，向每孔加入1毫升无菌PBS。该培养板可立即使用，也可在无菌PBS中于4摄氏度保存长达一周。

解剖当天，从培养板中移除 PBS。风干后将培养板置于紫外光下照射 2 至 4 小时。为分离海马神经元进行培养，将蛋白酶溶液解冻，并将铺板培养基预热至 37 摄氏度。

接着，用SLDS冲洗解剖出的海马体。然后将其取出，加入2毫升蛋白酶溶液，并在37°C下孵育15分钟。随后，用5至10毫升铺板培养基洗涤海马体外植体两次，再加入5毫升铺板培养基。

使用带有一毫升塑料吸头的移液器产生轻微涡流，将海马组织块解离为单细胞。上下吹打约40次，避免产生氧气气泡，直至溶液变浑浊且无较大组织块残留。随后，将细胞以1,125 × g离心3分钟。

吸除上清液，使细胞保持在培养基中，将细胞重悬于145毫升铺板培养基中。随后，每孔加入1毫升细胞悬液至24孔板中。将细胞在37摄氏度的铺板培养基中孵育2至4小时。

随后，移除铺板培养基，并更换为新鲜的维持培养基。两天后，将一半培养基更换为含有2 µM RSC的维持培养基，以抑制成纤维细胞、内皮细胞和胶质细胞的生长。接着，在细胞暴露于RSC两天后，再次更换为新鲜的维持培养基。

为了观察细胞形态，将构建体从原液用 Opti-MEM 培养基稀释至每微升含一微克，并涡旋混匀。然后，将脂质体介导的转染试剂用 Opti-MEM 培养基稀释，并涡旋混匀。随后，为每个孔分别准备一份构建体稀释液和一份转染试剂稀释液。

接下来，将构建物与Opti-MEM培养基的混合物和转染试剂与Opti-MEM培养基的混合物按1:1比例混合，并涡旋振荡。室温孵育20分钟。20分钟后，从每个孔中移除一半培养基，并将该培养基转移至洁净的锥形管中。

将离心管保留在培养箱中，然后将上一步制备的混合物100微升加入孔中剩余的培养基中。将细胞在37摄氏度下孵育20至30分钟。孵育期间，向锥形管中的培养基加入等体积的新鲜维持培养基，并将混合物置于同一培养箱中。

孵育结束后，从孔中移除含有转染溶液的培养基，并替换为锥形管中等体积新旧维持培养基的混合液。在此操作过程中，将移液管插入显微操作仪的螺口顶端，以固定其位置。拧紧连接在显微操作仪臂上的金属平头螺丝，使其夹住移液管未拉制的一端，位置应刚好位于橡胶管连接处的上方。

将移液枪与含有神经元的盖玻片表面呈45度角放置。打开荧光滤光片，打开光圈，并确保可通过物镜观察到荧光亮点。

使用显微操作仪，将移液管移动至使其尖端与荧光点对齐的位置，并将移液管下放至略高于细胞培养皿表面的位置。到位后，打开透射光源并关闭荧光光源。使用镊子，将一块载玻片从细胞培养板转移至含有2毫升室温Hank's缓冲液的细胞培养皿中，转移时使细胞面朝向移液管。

使用细调焦旋钮和20倍物镜，将焦平面调至细胞上方约四整圈的位置。随后，利用显微操作器调整移液管尖端，使其通过目镜观察时位于视野左侧中央的焦平面上。移液管定位后，将显微镜聚焦于包含目标区域的焦平面。

对七天大的小鼠海马神经元进行成像，这些神经元经GFP转染，在施加喷 puff 操作前后以及随后的10分钟恢复期内均可见轴突。此处为同一神经元延时成像的线扫图（Kymograph）。红色箭头指示在30秒时开始施加190毫升H₂O喷 puff 操作后150秒内形成的串珠样膨大结构。

一旦掌握，若操作得当，该技术可在三小时内完成。在完成该步骤后，可进一步开展全细胞记录、时间分辨FRET和TIRF成像以及钙成像等其他方法，以回答更多科学问题，例如机械应力对神经元电信号传导、钙信号、蛋白质转运与相互作用的影响。该技术建立后，为研究光诱导创伤性脑损伤的科研人员阐明活神经元中轴突串珠样结构形成的分子机制铺平了道路。

观看本视频后，您应能充分理解如何开展实验以研究中枢神经元的机械感觉。