用于原子力显微镜成像的细菌固定方法

原子力显微镜（AFM）利用对表面的机械探针扫描，可在无需对样品进行化学处理的情况下生成高分辨率图像。在本视频中，细菌被固定在明胶包被的云母表面，并在液体环境中通过原子力显微镜进行成像。首先，将云母片切割成适合原子力显微镜平台的小方块，去除云母的顶层后，将云母片用明胶包被。

接下来，将一滴细菌悬液置于明胶包被的云母表面并铺开。使用移液枪头，将样品孵育10分钟。然后用洗涤液去除未结合的细菌。

将样品置于原子力显微镜（AFM）液体池中成像，以获得活细菌的高分辨率图像。与现有的ISO多孔滤膜固定等方法相比，该技术的主要优势在于能够可靠地固定杆状和球形细菌。此外，细胞表面更大比例的区域可被AFM探针接触。

与其它显微技术相比，原子力显微镜的一个关键优势在于能够开展单细胞研究，可对细胞形态、隔膜形成以及胞质分裂进行探究。初学者在使用该方法时往往会遇到困难，原因在于他们倾向于使用未经验证能否有效固定细菌的明胶，或使用在复杂培养基中培养的细菌，而培养基中的成分会干扰细菌在明胶表面的黏附。我们最初构思该方法源于20世纪70年代的实验，当时已实现了细菌的固定。

用于光学显微镜和放射自显影实验的明胶包被玻片。本示例中，活的革兰氏阴性细菌被固定用于荧光显微成像，但该方法同样适用于革兰氏阳性细菌。制备MICA时，首先用剪刀将其裁剪至适合原子力显微镜（AFM）载物台，并适配AFM湿室的尺寸。

接下来，将透明胶带贴在云母表面并撕下，以剥离切割后云母片的外层。持续从两侧去除外层，直至仅剩光滑且完整的云母层。制备明胶溶液时，向一个实验室瓶中加入100毫升蒸馏水，并放入微波炉中加热。

当水开始沸腾时，将其从微波炉中取出，加入 0.5 克明胶，并轻轻摇晃容器，直至明胶完全溶解。注意：牛源明胶不适用于此操作步骤，推荐使用猪源明胶。

将瓶子放在实验台上，使其冷却至60至70摄氏度。然后倒入足量的明胶溶液至一个小烧杯中，确保能够用镊子将MICA完全浸入。将一块MICA方片浸入温热的明胶溶液中，并迅速取出，立即进行下一步操作。

将涂有明胶的云母片边缘朝下放置在纸巾上，并倚靠在微型离心管架上，于室温空气中晾干过夜。涂有明胶的云母片至少可在两周内使用。如果涂有明胶的云母片在数周内不使用。

将其置于覆盖的培养皿中的滤纸上，室温保存。多余的明胶溶液可冷藏保存，通过将储备液重新加热至60至70摄氏度，大约可使用一个月。重新加热时必须注意避免明胶沸腾。

在将细菌接种到明胶包被的云母片上之前，需确保细菌浓度适宜。使用分光光度计测定细菌样品在600纳米处的光密度值。OD值在0.5至1之间为最佳。

接下来，取一毫升培养物转移至微量离心管中，离心后收集沉淀。使用移液器吸除上清液，然后用一毫升过滤的去离子水或缓冲液洗涤沉淀。轻轻吹打重悬沉淀。

将离心获得的沉淀物重新悬浮，并立即用500微升纳米纯去离子水重悬沉淀物。细菌悬液应明显浑浊，以确保细胞浓度足够，用于荧光显微成像。

如果存在渗透休克的担忧，可在成像溶液中添加 0.25 摩尔的蔗糖。我已将这种细菌重悬于水中，但不必担心尝试其他液体。例如，我们曾使用 0.25% 蔗糖进行过实验，因此可尝试其他液体，观察是否同样有效。

每个样品准备两张载玻片。使用微量移液器，将10至20微升细胞悬液加入经明胶包被的表面。然后，为获得适合荧光显微成像的足够覆盖面积，用微量移液器吸头在X和Y方向上将液滴均匀铺开。

使用移液枪时注意不要让枪头接触明胶表面，将样品在室温下孵育10分钟。接着，用流水冲洗样品，并通过将样品边缘接触纸巾或滤纸以吸去多余的液体。随后，用氮气气流快速吹干其中一张载玻片。

然后目视检查载玻片。若出现不透明斑点，表明细菌在洗涤步骤中未被完全去除。另一张将用于成像的载玻片不得使其干燥。

将其放入原子力显微镜的液体样品台中，并使用夹具固定；用微量移液器向样品台内加入水。在进行液体成像前预先准备好原子力显微镜是一个很好的做法。确保用于液体成像的微悬臂已安装在原子力显微镜中，并与激光对准。

使用配备100微米扫描头和Vico氮化硅探针（标称弹性常数范围为0.01至0.1纳牛顿/纳米）的Pico Plus原子力显微镜，进行原子力显微成像。显微镜准备就绪后，将a FM扫描器和样品台插入显微镜中。通常，我们以每秒0.5行至每秒1行为成像速度，分辨率设置为每行128至512个数据点。

将仪器设置为每行采集 128 至 512 像素的图像。扫描速度设为每秒 0.5 至 1 行。然后根据需要调整原子力显微镜（A FM）的设定点和增益，以获得最佳图像。

最后，采集图像。大肠杆菌细菌按照本视频所述方法固定在明胶包被的云母上，然后在 0.005 摩尔的 PVS 中进行成像。采用此方法。

在采集的图像中，Scepter 清晰可见，细胞表面光滑，无脱水迹象。相比之下，此处所示的相同大肠杆菌在空气中的图像通常会显示出在液体中看不到的结构。在此情况下，细胞因脱水而呈现环状外观，并可观察到菌毛等细菌附属结构，如 FIA。

观看本视频后，您应能充分理解如何在液体环境中为荧光显微成像（FM成像）制备细菌样品。一旦掌握该技术，若事先已完成明胶包被微表面的制备，则整个操作可在约一小时内完成。在实施该实验流程时，选择合适的明胶类型并确保细菌具有适当的浓度至关重要。

还可以进行其他测量，例如利用FN悬臂作为力传感工具，对细菌表面进行力的测量。此外，可将特定的探针分子连接到原子力显微镜（AFM）针尖，以与细菌表面的特定靶标相互作用，从而识别并测量相互作用力。通常情况下，请务必注意，当使用该方法处理致病性细菌时，必须始终采取适当的预防措施。